持续性与间歇性低载荷机械振动对成骨细胞增殖与分化的影响

赵 滨 谭 磊 郝宝辉 王林祥 乔伟松 陈玉颖 刘 超 李 晨 朱 东

(吉林大学白求恩第一医院，吉林 长春 130021)

持续性与间歇性低载荷机械振动对成骨细胞增殖与分化的影响

赵 滨 谭 磊 郝宝辉 王林祥 乔伟松 陈玉颖1刘 超 李 晨 朱 东

(吉林大学白求恩第一医院，吉林 长春 130021)

目的 观察不同低载荷振动方式对成骨细胞增殖与分化的影响。方法 应用振动加载器给予培养的成骨细胞MC3T3-E1以强度为0.25 g、频率35 Hz的振动载荷，设置空白组(A组)，持续振动10 min(B组)及振动5 min间歇5 min再振动5 min(C组)两种加载模式组，加载结束后分别检测各组MC3T3-E1细胞的增殖能力(CCK-8法)、碱性磷酸酶(ALP)活性及Runx-2蛋白的表达变化。结果 3组之间成骨细胞增殖情况无明显统计学意义(P=0.742)，B组与C组ALP活性及Runx-2蛋白的表达明显高于A组，C组的ALP活性及Runx-2蛋白的表达显著高于B组(P<0.05)。结论 低载荷机械振动对成骨细胞的增殖并无影响，然而低载荷机械振动可以促进成骨细胞的分化，特别是适当的间歇低载荷机械振动能够更加明显的促进成骨细胞的分化。

持续性低载荷机械振动；间歇性低载荷振动；成骨细胞；增殖；分化

骨质疏松引起的公共健康负担一直居高不下，特别是低能量损伤使得老年骨质疏松患者罹患骨折的风险增加，同时其引发的高残障率和死亡率已成为一项严重的公共健康威胁〔1〕。目前为止，关于防治骨质疏松的研究主要有以下几个方面〔2～4〕：电刺激、低强度脉冲超声波、体外冲击波疗法、高能震荡波、高压氧吸入、叩击式骨应力刺激仪、针刺疗法、中药熏洗加关节松动训练等，但这些方法的治疗效果并非令人完全满意且尚存在一定的争议。研究表明，低载荷(频率32～37 Hz，加速度0.2～0.3 g)振动能够促进骨的生长并对抗骨质疏松〔5～8〕。然而以上诸多研究都是通过各种不同的持续加载方式作用于研究对象，本研究将通过对成骨细胞施加间歇性的低载荷振动来研究间歇的加载是否会产生不同的效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料 小鼠成骨细胞株MC3T3-E1购买自协和医科大学基础医学研究所，α-MEM(HYCLONE，美国)，新生牛血清(杭州四季青生物公司)，CCK-8试剂盒(南京凯基生物有限公司)，碱性磷酸酶(ALP)活性检测试剂盒(南京凯基生物有限公司)，Runx-2鼠单克隆抗体(Abcam，美国)，羊抗小鼠二抗(博奥森，北京)，GAPDH内参(博奥森，北京)，一次性细胞培养板(Corning，美国)。

1.2 成骨细胞的培养 将成骨细胞接种于含10%胎牛血清的α-MEM培养基中，培养瓶放置于37℃ 5%CO2的培养箱中培养，每2天换液1次，细胞生长至铺满培养瓶底部80%时按照1∶3传代。

1.3 细胞加载与分组 待培养瓶中细胞生长至铺满培养瓶底部80%时，换成不含血清的培养基，继续培养24 h以同步化细胞，然后将细胞消化，吹打均匀后用含血清培养基稀释60倍接种于6孔空培养板中，继续培养24 h。将接种于6孔板的细胞分为3组：空白组(A组)，持续振动10 min(B组)，振动5 min间歇5 min再振动5 min(C组)；其中B、C组均给予强度0.25 g，频率35 Hz的振动载荷。

1.4 成骨细胞增殖检测 分别检测加载3、5、7 d时成骨细胞的增殖情况。将各组细胞消化后制成等体积的细胞混悬液，按照说明书检测各组在450 nm处的吸光度。计算各组细胞活力，最终与A组相比。

1.5 成骨细胞ALP活性检测 每天按照预定的加载方式加载成骨细胞，待观测到细胞铺满培养板底面积的80%后终止加载。将成骨细胞消化、离心并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次。将离心好的细胞加入200 μl含0.1% Triton X-100细胞裂解液，吹打均匀，4℃裂解12 h，然后用超声细胞破碎仪再次处理细胞。将处理好的样本按照给定的操作步骤检测各组ALP活性。

1.6 Runx-2蛋白表达的检测 每天按照预定的加载方式加载成骨细胞，待观测到细胞铺满培养板底面积的80%后终止加载。消化、洗涤并离心收集细胞。RIPA强效裂解液冰上裂解细胞20 min，15 000 r/min离心20 min后取上清，并检测蛋白浓度。各组样品加入上样缓冲液100℃加热10 min备用。配制分离胶及浓缩胶，每孔上样20 μg蛋白样本，电泳浓缩胶45 min，分离胶45 min，湿法转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭1 h，1∶1 000一抗4℃孵育过夜，充分洗膜3次，1∶5 000二抗室温孵育1 h，充分洗膜3次后显影。

1.7 统计学分析 采用SPSS11.0软件行t检验。

2 结 果

2.1 不同加载方式对成骨细胞增殖的影响 分别检测各组在加载3、5、7 d后成骨细胞增殖情况(见图1)。A、B、C 3组之间的细胞增殖相比差异并无明显统计学意义(P=0.742)。

图1 不同加载方式对成骨细胞增殖的影响

2.2 不同加载方式对成骨细胞ALP活性及Runx-2蛋白表达的影响 B、C组在接受低载荷的振动加载后，ALP活性〔(9.51±1.05)U/ml、(16.70±1.44)U/ml〕及Runx-2(47 801、98 471)较A组〔(5.03±0.96)U/ml，35 673〕有明显的升高(P<0.05)，C组明显高于B组(P<0.05)。

3 讨 论

老年性骨质疏松已经成为一项严重威胁老年人健康的疾病，Rubin教授早期将低载荷机械振动用于骨科治疗及康复领域，他通过大鼠、羊、火鸡等动物实验发现低载荷机械振动可以促进骨细胞生长，拓展了这种机械加载方法在治疗骨科疾病方面的应用价值〔5，8，9〕。

成骨细胞是在成骨过程中起调控作用的关键细胞〔10〕。在成骨过程中，成骨细胞的增殖与分化是两个非常关键的步骤，本实验研究结果显示在成骨细胞增殖方面，A、B、C三组之间并未出现明显的差异，然而关于力学加载对于成骨细胞增殖具体会产生哪种影响目前仍然存在争议，但是我们认为产生这种现象的原因可能与细胞种类、力学加载类型有关，这仍需要进一步研究。ALP是成骨细胞分化的早期标志因子〔11〕，Runx-2蛋白被认为是调节骨平衡响应机械负荷的关键因子〔12，13〕，因此通过检测ALP及Runx-2的变化可以初步检测成骨细胞的分化情况。我们的研究发现，C与B两组在受到低载荷机械振动加载后，其ALP活性及Runx-2的表达均较A组有显著升高，这与以往的研究吻合。

本研究结果的振动加载所产生的促进成骨细胞分化的效果优于持续的振动加载。产生这种结果可能是因为成骨细胞在接受力学刺激一定时间后产生了疲劳或者是适应，进而导致其不能进一步对力学信号产生响应。当我们停止力学刺激一定时间后，成骨细胞得到休息不再疲劳或者是再次恢复其对力学刺激的敏感性，其后再次接受力学刺激后能够再次响应，较持续振动相同时间产生更明显的效果，但是这种猜测需要深入研究。

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〔2016-09-09修回〕

(编辑 郭 菁)

国家自然科学基金资助(No.11432016,11272134,11602093)

朱 东(1941-)，男，教授，主要从事四肢骨折的治疗骨生物力学研究。

赵 滨(1990-)，男，硕士，主要从事四肢骨折的治疗骨生物力学研究。

R681

A

1005-9202(2017)09-2084-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.002

1 大连医科大学