植物凝集素上调小鼠免疫器官MDSC细胞的研究

张潇涵，李江超，刘 擎，周泽启，仰明明，王丽京 （广东药科大学血管生物学研究所，广东广州510006）

·基础与转化医学·

植物凝集素上调小鼠免疫器官MDSC细胞的研究

张潇涵，李江超，刘 擎，周泽启，仰明明，王丽京 （广东药科大学血管生物学研究所，广东广州510006）

目的：探讨小鼠腹腔注射植物凝集素（PHA）后血液、脾脏、骨髓中的MDSC数量的变化，明确PHA对小鼠血液、脾脏、骨髓MDSC的作用.方法：小鼠腹腔注射PHA后，提取小鼠血液、脾脏及骨髓进行细胞裂解，标记抗体后采用流式细胞仪进行检测和分析.结果：PHA处理组小鼠的骨髓、脾脏、外周血中MDSC百分比明显比生理盐水组高，骨髓中生理盐水组双阳性平均为36.6%，而PHA组双阳性达到56.4%，差异有统计学意义（P＜0.05）.脾脏中，生理盐水组双阳性平均为3.5%，然而植物凝集素组双阳性能达到11.5%左右，差异有统计学意义（P＜0.05）.外周血中，PHA处理组MDSC百分比明显升高，对照组MDSC平均百分比占4.6%，而PHA组MDSC平均百分比占19.8%，差异有统计学差异（P＜0.05）.结论：植物凝集素腹腔刺激小鼠后，可促使小鼠血液、脾脏、骨髓中MDSC浓度的上调.

植物凝集素；MDSC细胞；细胞分化

0 引言

凝集素是一种糖结合蛋白，广泛存在于动物、植物和微生物中.植物凝集素（Phytohaemagglutinin，PHA）是低聚糖（由D⁃甘露醇、氨基葡萄糖酸衍生物构成）与蛋白质的复合物，属于高分子糖蛋白类，存在于一些植物中.植物凝集素根据其来源可分为豆科凝集素（存于豆类种子中，可从豆类种子中提取出来）、几丁质结合凝集素、单子叶植物甘露糖结合凝集素、葫芦科韧皮部凝集素、苋科凝集素等［1］，均属于中药提取物，且它们对红细胞可产生一定的凝集作用，故而称做植物血凝素或植物凝集素［2］.未成熟髓样抑制细胞（Myeloid de⁃rived suppressor cells，MDSC）是一群异质性细胞，来源于骨髓系统，包括未成熟的巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞等，其共同的表面标志为Gr⁃1＋／CD11b＋，具有很强的免疫抑制作用，是引起肿瘤免疫逃逸的主要细胞群［3－5］.MDSC细胞在以往研究中，其升高主要是在肿瘤患者和荷瘤小鼠中观察到的，MDSC能够发挥强大的免疫抑制作用，在肿瘤发展中扮演重要角色.MDSC细胞能够抑制机体免疫功能已经被广泛认可，PHA能够刺激淋巴细胞增殖，而PHA与MDSC二者相互作用关系尚不清楚.目前豆科类凝集素已发现了70多种，且研究较为清楚，所以采用了豆科类凝集素用于研究.本研究探讨了PHA对MDSCs的影响，为研究未患瘤状态下MDSC细胞各项功能提供依据.

1 材料和方法

1.1 小鼠C57BL／6小鼠购买自广东省医学实验动物中心，许可证号SCXK（粤）2013－0002.小鼠相关实验获得广东药科大学伦理委员会许可.

1.2 试剂和仪器1 mL注射器；EDTA.K2抗凝采血管；流式细胞术检测抗体：Gr1⁃PE（货号12⁃5931）；CD11a⁃FITC（货号11⁃0112），抗体（购自eBioscience公司）；红细胞裂解液（购买自life technologies）；尼龙筛网（货号22363548），Fisherbrand；流式细胞仪（型号：BD FACSCantoⅡ）.瑞氏⁃姬姆萨染色液（购自于珠海贝索生物技术有限公司）；载玻片、盖玻片（均购自于江苏世泰实验器材有限公司）；PHA（购自于广州市医药工业研究所）.

1.3 实验方法

1.3.1 PHA腹腔注射 取C57小鼠6～8周，腹腔注射浓度为10 mg／mL的PHA 0.2 mL，每隔24 h注射一次，连续注射3次.

1.3.2 骨髓MDSC检测 将PHA腹腔注射后的小鼠麻醉处死后，取出小鼠后腿，在1XPBS缓冲液中将肌肉剥离，然后用1 mL PBS冲骨髓，吹打混匀，过70 μm尼龙筛网，取100 μL加入流式管中，各加入0.3 μL的Gr1和CD11b抗体，震荡混匀，室温避光孵育35 min，加入100 μL红细胞裂解液进行裂解红细胞，15 min后加入1 mL的PBS震荡混匀，在低速离心机1500 r／min，离心5 min；弃掉上清，加入1 mL PBS震荡混匀，在低速离心机1500 r／min，离心5 min；重复1次，弃上清，加入200 μL 1%多聚甲醛固定液固定，混匀，上流式细胞仪进行检测.

1.3.3 脾脏MDSC检测 将PHA腹腔注射后的小鼠麻醉处死后，将小鼠固定于夹板上，用手术器械取出脾脏，置于灭菌的1 mL冰冻1XPBS，轻轻研磨组织并吹打混匀，以下步骤同上.

1.3.4 血液MDSC检测 将PHA腹腔注射后的小鼠乙醚麻醉后，眼眶取血，防止凝血现象，将血液置抗凝管中，取100 μL加入流式管中，各加入0.3 μL的Gr1和CD11b抗体，震荡混匀，室温避光孵育35 min，加入100 μL红细胞裂解液进行裂解红细胞，20 min后加入1 mL的PBS震荡混匀，在低速离心机1500 r／min，离心5 min；弃掉上清，加入1 mLPBS震荡混匀，在低速离心机1500 r／min，离心5 min；重复1次，弃上清，加入200 μL 1%多聚甲醛固定液固定，混匀，上流式细胞仪进行检测.

1.3.5 血液、骨髓涂片 将PHA腹腔注射后的小鼠麻醉，眼眶取血滴在载玻片上，稍微晾干后，用甲醇固定10 min，进行吉姆萨染色；小鼠处死后，取出小鼠后腿，在1XPBS缓冲液中将肌肉剥离，然后用1mLPBS冲下骨髓，吹打混匀，5000 r／min，离心5 min，弃上清，将剩余混匀之后涂在在玻片上，甲醇固定10 min后，PBS冲洗自然晾干后，吉姆萨染色.

1.4 统计学处理采用数据的统计方法或中位表示，使用软件Gradprim5.0，采用t检验，假设条件P＜0.05时差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 PHA刺激后，骨髓、脾脏、血液中的MDSC升高

采用0.9%氯化钠生理盐水和10 mg／mL植物凝集素，以0.2 mL／只分别腹腔注射6～8周龄C57小鼠，每组5只，每隔24 h注射一次，共3次.取出骨髓、脾脏及外周血标上MDSC抗体（Gr1⁃PE，CD11b⁃FITC）进行流式检测.流式细胞术是一种生物学技术，是利用流式细胞仪对悬液中的单细胞或其他生物粒子标记的荧光信号进行检测，实现高速、逐一的多种参数分析和分选的技术.基于细胞自身的物理、化学特性，借助流式细胞仪的单细胞高速，通过阈值、光电倍增管电压设置、阴性对照设置、荧光补偿调节以及多方式设门等对细胞进行分析.流式仪上样细胞数量为10000个.调节电压及荧光补偿，结果发现，双阳性代表MDSC，植物凝集素组在骨髓、脾脏、外周血MDSC明显比生理盐水组高，骨髓中生理盐水组双阳性平均为36.6%，而植物凝集素组双阳性MDSCs细胞达到56.4%，差异有统计学意义（P＜0.001，图1）.脾脏中，生理盐水组双阳性平均为3.5%，然而植物凝集素组双阳性能达到11.5%左右，差异有统计学意义（P＝0.0002，图2）.同样，外周血中，植物凝集素双阳性明显升高，对照组双阳性平均百分比占4.6%，而实验组双阳性平均百分比占19.8%，差异有统计学意义（P＝0.0005，图3）.

图1 植物凝集素腹腔注射对小鼠骨髓中MDSC的影响

图2 植物凝集素腹腔注射对小鼠脾脏中MDSC的影响

图3 植物凝集素腹腔注射对小鼠外周血中MDSC的影响

2.2 PHA刺激后造成骨髓细胞发生改变，而血涂片发生变化不大植物凝集素腹腔刺激小鼠后，其骨髓细胞变化明显，吉姆萨染色后在显微镜下观察，实验组较对照组骨髓细胞数目明显增多，其胞核变小，形态各样，核变明显.而血涂片中，染色深紫色的为淋巴细胞，胞浆较少，胞核较大，PHA腹腔刺激后，其淋巴细胞稍有增多，但不明显（图4）.

图4 植物凝集素腹腔注射对小鼠骨髓细胞、外周血细胞产生影响，细胞数目增多，胞核变化多样

3 讨论

PHA提纯后其成分含量多少可分为两类，提纯后蛋白含量较多的称为PHA⁃P，糖蛋白多的则称为PHA⁃M，需要进一步深入研究［6］.20世纪初期有研究表明植物凝集素对人和动物红细胞有凝血作用，进一步研究发现其药理作用可作为一种有丝分裂原，通过激活小淋巴细胞使之转化为淋巴母细胞，从而进行分裂增殖，同时可释放出一些淋巴因子［7］；此外，PHA还具有使巨噬细胞的吞噬功能提高的能力［8－10］.近年研究发现PHA对病毒侵袭的细胞有杀伤作用，可对人体食管癌及肝癌细胞株发挥抑制作用，同样发现对艾氏腹水癌也发挥抑制作用；可延长荷瘤小鼠的生存期［11－13］；此外，还能促进骨髓造血功能，提升白细胞数量，可以对小鼠骨髓细胞微核发生率造成影响［14－15］.在以往研究中，植物凝集素大都是作为免疫治疗剂进行应用的，其主要配合放疗、化疗用于肿瘤患者，尤其是免疫功能受损而引起的疾病，例如急性白血病、晚期绒癌、乳腺癌、肠癌、鼻咽癌、再生障碍性贫血、迁延性肝炎等［16－17］.在体外，主要用于细胞，刺激增殖作用.也有文章报道PHA诱导的免疫力反应引起T细胞有丝分裂，会对不同种动物的繁殖阶段造成不同影响［18］.上述研究均没有涉及到MDSC，尚不清楚PHA对MDSC细胞的作用.而在本研究中发现植物凝集素进入血液、骨髓、脾脏中后MDSC的浓度升高.

有研究报道哺乳动物外源注射PHA，其静止代谢率无明显升高，进而说明PHA反应对哺乳动物本身不会引起能量学变化［19］.由此小鼠状态不会受到影响，本研究采用10 μg／mL PHA腹腔注射后，检测小鼠骨髓、血液、脾脏中MDSC细胞，植物凝集素组在骨髓、脾脏、外周血MDSC（双阳性代表MDSC）明显比生理盐水组高.MDSC细胞还通过促进肿瘤血管生成，促使肿瘤细胞侵袭及向远处器官转移等非免疫机制促进肿瘤的发生发展［20］.初步研究中发现植物凝集素能够明显刺激MDSC细胞上调，说明植物凝集素是对MDSC细胞这种异制性细胞群有一定的作用.尤其在骨髓中，植物凝集素对其影响更明显.骨髓富含大量未分化成熟的细胞，是机体造血系统，能制造出红细胞、血小板和各种白细胞.红细胞成熟后进入机体循环，白细胞能够杀灭病原菌，由此骨髓也是机体重要的免疫器官.其在植物凝集素作用下，MDSC细胞大量增多，主要在荷瘤小鼠中MDSC升高.在炎症、病毒感染、自身免疫疾病、创伤等病理状态下同样会导致MDSC积累.研究中小鼠状态尚可，由此推测植物凝集素作用引起了某些因子的变化进而促使未分化细胞转化为MDSC细胞，导致MDSC在骨髓积累.骨髓涂片中也可发现其细胞数目增多，进而能说明PHA确实影响了骨髓细胞分化.脾脏机体最大的免疫器官富含淋巴细胞和巨噬细胞，发挥细胞免疫和体液免疫功能，植物凝集素作用下，MDSC细胞也上调，说明PHA对脾脏中免疫细胞功能产生影响，促使MDSC大量形成，也可能是机体对外来PHA的应激反应导致某些炎症因子发生改变，诱导MDSC细胞分泌.PHA在体外会引起红细胞凝集现象已被广泛认知，同时也有文献报道PHA在体内达到一定浓度时同样也会引发血液凝集［21］.在PHA腹腔刺激后发现外周血中MDSC细胞升高明显，这说明PHA在体内对血液系统的影响不仅在凝血系统方面，免疫力反应也很明显，同时也有可能是骨髓中MDSC进入血液，使血液含有大量MDSC.同时有研究报道，植物凝集素会引起外周单核细胞分泌IL⁃6［15］，IL⁃6可诱导MDSC的产生，进而使得血液中MDSC增多.提示PHA在促进淋巴细胞增殖的同时可能降低了细胞的免疫功能，增加了MDSC的数量.

直接应用PHA可促进MDSC细胞增多，但对于免疫细胞尤其淋巴细胞变化待我们进一步研究验证.本研究PHA是通过何种途径调节了MDSC细胞，而这种增多的MDSC细胞是否也具有免疫抑制功能尚不清晰.MDSC在促进肿瘤发展中扮演重要角色，然而对MDSC的亚群和种类尚不清晰.这为我们研究MDSC细胞扮演角色提供了很好的方法，便于以后在未患瘤状态下MDSC细胞各项功能的研究.这对了解MDSC的多样性有一定的临床意义，同样PHA作为免疫学中重要的药物，具有较好的应用前景.

研究中小鼠为未荷瘤状态，没有在这方面进行研究.植物凝集素，尤其是豆类植物凝集素，在生长进化中形成了一种很强的抵御病虫害和动物消化的成分［22－23］，因此对动物有较强的抗营养作用，表现出急性恶心呕吐和腹泻，这与我们研究中发现实验小鼠精神状态差这一现象一致，其各器官的变化需要进一步全面观察.

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Study on the effect of phytohaemagglutinin on upregulating MDSCs of immune organ in mice

ZHANG Xiao⁃Han，LI Jiang⁃Chao，LIU Qing，ZHOU Ze⁃Qi，YANG Ming⁃Ming，WANG Li⁃Jing
Vascular Biology Research Institute of Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China

AIM：To investigate the changes in the number of MDSCs in blood，spleen and bone marrow after intraperitoneal injection of phytohaemagglutinin（PHA）in mice，and confirm the effects of PHA on MDSC in blood，spleen and bone marrow.METHODS：After intraperitoneal injection of PHA in mice，the red cell extracted from the blood，spleen and bone marrow was ly⁃sised，and MDSCs altering of labeled antibody was detected and analysed using flow cytometry.RESULTS：Percentage of MDSCs treated by Phytohaemagglutinin was significantly higher than that of the control group in bone marrow，spleen，peripheral blood.More detail，MDSCs in control group was 36.6%in bone marrow，while MDSCs in Phytohaemagglutinin group reached 56.4%，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.Average val⁃ue of MDSCs in spleen was 3.5%in control group，however that of the Phytohaemagglutinin group was 11.5%，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.Similarly，it is difference in peripheral blood（4.6%vs19.8%）.CONCLUSION：PHA can promote up⁃regulation of MDSC in blood，spleen and bone marrow in mice.

Phytohaemagglutinin；MDSCs；cell differentiation

Q95⁃33

A

2095⁃6894（2017）04⁃15⁃04

2017－02－17；接受日期：2017－03－03

国家自然科学基金（81472336，31471290），广东省科技计划（51343072，2014A020212313，2015A030302086）

张潇涵.E⁃mail：1123796468＠qq.com

王丽京.博士，教授.研究方向：分子肿瘤病理学、模式动物疾病模型.E⁃mail：wanglijing62＠163.com