不同地理种源丹参根系分泌物的GC—MS比较分析

兰英　沈晓凤　严铸云　王海　何冬梅　王苏琴　任波　陈新

摘要：为了阐明丹参根系分泌行为与遗传和环境的关系，以不同地理（四川省、山东省、河南省）种源丹参组培苗和根段材料，分别进行无菌和沙土培养。并利用GC-MS技术对丹参根系分泌物进行组分分析，从组培和盆栽丹参根系分泌物中分别检测出19种、36种物质，其中组培丹参根系分泌物以酚类、酯类为主。各种源丹参根系分泌物中有其特殊的成分，但所有分泌物中均含有十六烷棕榈酸、硬脂酸油醇酯、松油醇等，只是含量不同。土培条件下，根系分泌物中烃类、醇类、醛类在种类及含量上均有所增加，而酚类、酯类明显减少，尤其是酚类物质，增加2种酸类、2种甾醇类和1种萘胺、2种酰胺类组分，但未检出组培丹参根系分泌物中的1种酮类和3种脂肪胺类物质。研究表明，丹参根系分泌物的组成和相对含量受遗传和环境的影响，其中有机酸、甾醇类和酰胺类是环境胁迫下的主要分泌物，本研究结果将为提高丹参根际土壤养分高效利用提供一定参考。

关键词：丹参；根系分泌物；组培法；土培法；气相色谱一质谱

中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0301—05根系分泌物是植物与环境相互作用的媒介，在植物间、植物与微生物问的相互作用中具重要的生态学意义，其组成受遗传和环境的双重调控，在植物根系化感作用及根际营养调控中起着重要作用。研究表明三七、人参、西洋参、地黄、苍术等的根系分泌物具化感作用。丹参（Salvia mihiorrhiza Bge.）是多地栽培的药用植物，其中四川、河南、山东是丹参药材的道地产区。已有研究表明，丹参虽具广泛的土壤适应性，但不同产地丹参的有效成分和无机元素含量差异明显，并与遗传特性及土壤因子相关。本试验以四川省、河南省、山东省种源丹参为试验材料，研究不同遗传背景丹参在MS培养基和盆栽过程中根系分泌物的差异，旨在为深入研究丹参根系分泌物产生机制提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

丹参种源于2012年12月分别采自四川中江石泉乡、山东临沂吕匣镇，河南方城拐河镇3个不同产区，根段繁殖，翌年开花后，经鉴定均为唇形科植物丹参。沙土盆栽，完整挖出植株根系，剥取距离根表0～4 mm内的土壤约200 g，置阴凉处自然风干，研磨，过60目筛备用。

组培苗取上述盆栽植物作外植体，经组织培养获取丛生芽，于1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA（含蔗糖1.5%，琼脂0.8%，pH值5.8～6.0），温度（25±2）℃，光照度约5 000 k，光照时间11 h/d条件下培养50 d后，取其根部的培养基备用。

1.2试剂与仪器

仪器：Agilent GC6890/MSD5973气相色谱-质谱联用仪；JA5003型电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；KQ5200超声仪（昆山市超声仪器厂有限公司）；RE5203旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；TDZ5-WS台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

试剂：乙酸乙酯（分析纯）（成都科龙试剂化工厂，批号20130718），二氯甲烷（成都科龙试剂化工厂，批号2013093001），甲醇（分析纯）（成都科龙试剂化工厂，批号20110415），无水硫酸钠（分析纯）（成都科龙试剂化工厂，批号20130705）。

1.3试验方法

1.3.1培养基中根系分泌物的提取 选取长势一致的丹参组培苗（山东），剥离其根部附近的培养基，等分成3份，分别置于圆底烧瓶中，一份加入200 mL蒸馏水及100 mL乙酸乙酯于90℃加热融化后回流提取30 min；另一份加入相同的溶剂后于100 W、40℃超声提取30 min，放置冷却后，分别分离乙酸乙酯层，将琼脂层重新转入原烧瓶中，用1 mol/L NaOH将pH值调至9，各加入100 mL乙酸乙酯，分别以上述同样的方法提取30 min，合并各样品2次乙酸乙酯提取液；最后一份培养基中加入200 mL甲醇，于100W，40℃超声提取45 min，以5 000 r/min离心10 min，分离上清液；将3份提取液用无水硫酸钠脱水后，于35℃减压浓缩至干，以二氯甲烷溶解并定容至1 mL，用于GC-MS分析，确定提取方案。以最佳方法分别制备山东、四川、河南丹参组培苗根系分泌物供试液。并以未使用过的MS培养基制备空白供试液。

1.3.2根际土壤浸提液的制备 分别称取3种丹参根际土各约50 g，置500 mL锥形瓶中，按1：5比例加入蒸馏水，于30℃超声提取30 min，离心，上清液用1 moL/L HCl调pH值至4，以等体积的乙酸乙酯萃取2次，分离乙酸乙酯层，水相用1 mol/L NaOH调节pH值至9，再用等体积乙酸乙酯萃取2次，合并2次所得乙酸乙酯萃取液，用无水硫酸钠脱水后，于35℃减压浓缩至干，以二氯甲烷溶解并定容至1 mL，作供试品溶液。并从加入蒸馏水开始同时制备空白供试液。

1.3.3根系分泌物的GC-MS测定 提取的根系分泌物用气相色谱一质谱联用仪（Agilent GC6890/MSD5973）进行分析。色谱条件：色谱柱db-35：（30 m×0.25 mm，0.25μm）；载气：He；分流比：2：1；柱恒流：1 mL/min；进样量：1μL；进样口温度：260℃。升温程序：组培根分泌物的程序升温条件：初始温度60℃，以10℃/min升温到300℃，保持16 min；土培根分泌物程序升温条件：初始温度100℃，以5℃/min升温到150℃，再以3～C/min升温到270℃，然后以5℃/min升温到300℃，保持10 min。质谱条件：电离方式：EI，电子能量：70 eV，离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；質量扫描范围：20～500 amu；采集方式：SCAN扫描。

2结果与分析

2.1组培苗根系分泌物的提取方法

按“1.3.3”节中的GC—MS条件对3种不同提取方法得到的丹参组培苗根系分泌物进行分析，并扣除空白试液，得其总离子流图（图1）。由图1可见，3种提取液中均能检测出丹参组培根系分泌物，但从其所含组分的种类及含量上比较，乙酸乙酯回流提取法（S1）检测出的组分最多，各组分含量更高；其次是乙酸乙酯超声提取法（S2）；而甲醇超声提取法（S3）检测出的组分最少。因此，确定乙酸乙酯回流提取法（S1）用于本试验丹参组培苗根系分泌物的样品制备方法。

2.2丹参组培苗根系分泌物的组成分析

按“1.3.3”节中的GC-MS条件对3个不同地理种源丹参组培苗根系分泌物进行分析，并扣除相应的空白试液，得到其总离子流图（图2）；对各成分的质谱图进行计算机质谱库（NIST08）检索及人工解析，确定化合物结构，根据质谱离子流图的峰面积，应用峰面积归一化法确定各化合物的相对含量。3个不同种源的丹参组培苗根系分泌物共鉴定了19种成分，主要包括7大类成分，均以酯、酚类成分最为丰富，相对含量较高，其次分别是烃、醇、胺类（表1）。但各类组分的组成和含量有所不同，其中山东组培苗根系分泌物中酯类成分最为丰富，占总检出量的28.02%，其次是酚类（22.78%），主要以4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、硬脂酸油醇酯、十六烷棕榈酸等酚、酯类成分为主，含量高达41.48%。十六烷棕榈酸成分在山东种源的组培苗根际含量较高，约为河南和四川的2倍，而邻苯二甲酸二甲酯则相反，在河南省和四川省种源组培丹参根际含量为山东的2倍左右，硬脂酸油醇酯为山东省和四川省组培苗根系分泌物共有组分，但在山东种源组培丹参根际中的含量约为四川的3倍。2-（4-甲基-3-环己烯基）-2-丙醇（松油醇）为山东和河南根际培养基的共有组分，含量相近。而河南省、四川省组培苗根系分泌物中均以酚类成分含量最大，分别高达25.11%、25.53%；其次是酯类成分，相对含量分别为15.14%、21.23%，均以4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、邻苯二甲酸二甲酯、6，10，14-三甲基-2-十五烷酮、二十六烷、N，N-二甲基苄胺等组分含量较高，9-十八碳烯酰胺仅存在于河南和四川根际培养基中，而正十五烷为河南省特有组分，但含量较低。

2.3土培丹参根系分泌物的组成分析

按“1.3.3”节中的GC-MS条件对3个产地丹参沙土盆栽苗根系分泌物进行分析，并扣除相应的空白试液值，得到其总离子流图（图3）；对各化学成分质谱图进行计算机质谱库（NIST08）检索及人工解析，确定化合物结构，根据质谱离子流图的峰面积，应用峰面积归一化法确定各化合物的相对含量（表2）。

从沙土盆栽丹参的根际土壤浸提液中共鉴定出35种物质（表2），其中山东丹参根际土壤浸提液中鉴定出24种成分，占总检出成分的84.54%；河南丹参鉴定出30种，占86.11%；四川丹参鉴定出34种化合物，占88.57%。3种丹参的盆栽根际土壤浸提液中均包括烃、醇、酯、酚、醛、酸、酰胺、胺类成分，其中烃类成分最丰富，含量最高，主要为15～29个碳原子的直链烷烃，其中长链的烷烃（如二十六烷、二十九烷）为优势组分，与杨先国等的报道相似。而正十八烷、正十九烷、环氧十六烷和稠环芳烃惹烯为四川丹参特有的根系分泌物组分，但含量均较低；正十五烷为河南丹参根系分泌物中特有组分，这与其组培苗根系分泌物相同；1-十六烯为山东和四川丹参共有的根系分泌成分。其次分别是酯类、醇类、酸类及酰胺类，酯类成分主要为苯甲酸酯类衍生物，其中邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸正丁异辛酯在3种源丹参根系分泌物含量较高，而邻苯二甲酸二甲酯、己二酸二辛酯仅在河南和四川丹参中检出，且含量均较低；3种丹参根系分泌物中都含有3种有机酸，均以棕榈酸含量最高；而酰胺、酚类成分中芥酸酰胺、油酸酰胺两烯酸酰胺及苯酚为三者共有组分，且含量较高，9-十八碳烯酰胺、2，6-二叔丁基对甲酚仅在河南和四川丹参根系分泌物中检出，其余成分相对含量较低。此外，河南省和四川省丹参根系分泌物中均检出了豆甾醇和植物甾醇，而山东丹参根系分泌物中未见此类成分。

2.4组培和土培丹参根系分泌物的比较

组培和土培丹参的根系分泌物中均以烃类、醇类、酯类最丰富，含量较大。除苯酚、苯甲醛、9-十八碳烯酰胺及部分直链烷烃（十五烷、二十二烷、二十六烷）外，其他类型的根系分泌物成分差异较大。从化合物种类来看，组培丹参根系分泌物中特有1种酮类（6，10，14-三甲基-2-十五烷酮）和3种脂肪胺类（N，N-二甲基苄胺、十二烷基二甲基叔胺、N-甲基-N-十四烷基苄胺）成分，且相对含量较大；而土培丹参根系分泌物中未检出酮类，增加了2种有机酸（棕榈酸、3-甲氧基壬酸）、2种酰胺（油酸酰胺、芥酸酰胺）和2种甾醇类（豆甾醇、植物甾醇），且含量较高。从各组分含量变化上，根系分泌物中烃类、醇类、醛类的种类及含量，土培较组培丹参均有所增加，而酚类、酯类组分土培较组培明显减小，尤以酚类物质最明显。

3讨论

植物根系分泌物的研究方法种类繁多，但各有不足，原因在于植物根系分泌物含量较少，收集困难，组分复杂难以分离、纯化。目前，已发现的植物根系分泌物主要包括烃类、酚酸及其衍生物类、醛酮类、萜类、生物碱类等，其复杂的种类和结构决定了其作用途径的多样性。本试验采用无菌组培法和盆栽土培法培养不同种源丹参，比较分析了不同种源丹参在组培和土培条件下根系分泌物组成的差异。结果发现，丹参的根际分泌行为与遗传和环境密切相关。无菌全营养组培条件下，以酯、酚類为主，但不同种源丹参还存在一些特有组分，这些主动分泌的物质其生物学意义有待进一步研究。沙土培养下，丹参根系分泌物增加了有机酸、酰胺及甾醇类成分，原因是植物在逆境胁迫条件下，导致植物生理代谢障碍或组织损伤，使植物主动或被动向根际环境释放各种化学物质，增加根分泌物数量和种类以适应环境胁迫。其中有机酸的增加，与文献报道营养胁迫下植物会分泌有机酸以活化根际养分结果一致，而酰胺及甾醇类与植物根际养分吸收的关系未见相关报道。

植物根分泌物组分复杂，其种类、数量与植物的种类、发育阶段、营养状况、根际微生态环境及生长环境等有密切关系，植物通过代谢产生的根分泌物，一部分作为化感物质影响植物的生长，如已有研究报道称植物根系分泌的二十九烷（油菜）、十六酸（苍术）、植醇、1-氯十六烷、二十烷（重茬大豆）、十六烷（橡树）、十九烷（桉树）、邻苯二甲酸丁酯十一烷基酯（大蒜）。等对植物生长起着一定程度的抑制作用。另一部分主要用来适应不良环境，如植物缺磷时，植物根系可通过有机酸、质子或磷酸水解酶分泌量增加，大大提高根际土壤中难溶性养分的溶解度，从而提高养分的有效性，改善植物缺磷状态。本试验发现丹参在土培条件下，根系分泌物中新增有机酸、酰胺及甾醇类成分，且烃类、醇类、醛类组分含量均有所增加，其生态学意义有待进一步研究。