姜黄素对H22肝癌、S180肉瘤小鼠的抑瘤作用及机制研究

刘碧霞　　章红燕

[摘要] 目的 探讨姜黄素对 H22肝癌、S180肉瘤小鼠的抑瘤作用及机制，为H22肝癌临床治疗提供实验依据。方法 采用ICR小鼠接种H22瘤株、S180肉瘤株分别建立肿瘤模型，采用姜黄素进行干预，明确其抑瘤作用，分阳性对照组（CTX化疗组）、阴性对照组（生理盐水组）、姜黄素低剂量组、姜黄素中剂量组、姜黄素高剂量组，每组12只。对比分析治疗组各组用药前后体重、抑瘤率的差异；动物处死后，取肿瘤组织，采用荧光定量RT-PCR测定肿瘤组织中TGF-β1RⅡ、NF-κB、CyclinD1、VEGF表达。 结果 姜黄素对肝癌和肉瘤小鼠肿瘤生长抑制率为36.04%和41.27%，有明显的抑瘤作用。与模型组比较，给药组肿瘤组织NF-κB、CyclinD1、VEGF的表达水平下调，TGF-β1RⅡ的表达水平显著升高。 结论 姜黄素通过上调肿瘤组织TGF-β1RⅡ，下调NF-κB、CyclinD1、VEGF表

肝癌是我国高发的、危害极大的恶性肿瘤。原发性肝癌（Primary liver cancer，PLC）的病因及分子机制尚不完全清楚，目前认为其发病是复杂过程。近年来传统中医中药在肝癌综合治疗中有明显优势[1-3]。中医药治疗与手术、放疗、化疗、免疫治疗一道被称为当前针对恶性肿瘤的五大类治疗。近几年来，从中药中寻找结构新颖和作用独特的抗肿瘤活性成分或先导化合物是抗肿瘤药物研究的一条重要途径。目前上市的抗肿瘤药很多来源于中药的提取及开发，包括紫杉来源的紫杉醇、多西紫杉醇，三尖杉来源的高三尖杉酯碱，人参来源的人参皂甙 Rg3 等。

姜黄，又名黄姜、郁金、宝鼎香，为姜科植物姜黄的根茎，主产于浙江、福建、湖北、四川等地，为浙江省重要的本土中药材。药理研究表明，姜黄具有保肝、利胆、抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗艾滋病、抗生育、降血脂、抗病原微生物及抗病原虫、加快创伤愈合、抗突变等作用。姜黄素主要是从姜科植物郁金中提取的一种化合物[4]。1985年Kuttan等[5]首次提出姜黄素具有抗肿瘤的作用，此后有大量研究进一步证实。吉鸿等[6]发现姜黄主要提取物姜黄素可通过抑制NF-γB-Snail信号途径来抑制乳腺癌细胞上皮间质转化过程（EMT），进而抑制其侵袭转移能力。范德生等[7]发现用姜黄素处理鼻咽癌细胞系CNE-2Z后，肿瘤细胞增殖明显受到抑制，同时细胞的侵袭和迁移能力明显降低，其机制可能与姜黄素下调EGFR的表达有关。宛传丹等[8]发现姜黄素可有效抑制肝癌细胞的增殖，并可进一步诱导细胞凋亡。刘鹏等[9]通过对免疫抑制小鼠实验，发现姜黄素能够提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数，增加B细胞抗体产生能力，增强免疫抑制小鼠脾淋巴细胞的增值，对固有免疫和适应免疫均有一定的增强作用。李然等[10]在药物毒性角度证实其安全性。介于其良好的安全性及广泛的抗肿瘤作用，本研究探讨其抗肝癌作用及具体的分子机制。

1 材料与方法

1.1一般材料

1.1.1 细胞株及培养 S180瘤株、人肝癌HepG2细胞株引自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库，将H22肝癌细胞株，S180瘤株接种于100 mm细胞培养皿中，加培养液，于培养箱中培养，2～3 d传代1次，取對数生长期细胞进行研究。

1.1.2 动物 ICR小鼠，SPF级，年龄：4～6周，体重18～22 g。浙江中医药大学实验动物中心，由常州卡文斯生物科技发展有限公司提供。实验动物生产许可证：SCXK（苏）2011-0003；实验动物使用许可证：SYXK（苏）2011-0036。

1.1.3 药物 姜黄素购自Sigma公司，分子质量368.38，以二甲基亚枫（DMSO）溶解，配制成100 mmol/L储存液，使用时用含10%胎牛血清RPMI-1640培养基稀释到所需浓度，稀释后的DMSO终质量分数<5%，置于-20℃避光保存。注射用环磷酰胺：200 mg/瓶，江苏恒瑞医药股份有限公司。

1.1.4 主要仪器 生物倒置显微镜（日本OLYMPUS IX51）；台式低速离心机（中国上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂80-2）；PCR仪器（美国ABI公司 9700型）。

1.2 实验方法

1.2.1 H22肝癌小鼠模型制备与分组 收集培养的人肝癌细胞HepG-2悬液，浓度为1×107个/mL，以每只0.1 mL接种于60只体重（20±2）g ICR小鼠右侧腋窝皮下。接种后随机分为阴性对照组、姜黄素低剂量组（10 μmol/L）、姜黄素中剂量组（20 μmol/L）、姜黄素高剂量组（40 μmol/L）、阳性对照组、每组12只。

1.2.2 S180肉瘤小鼠模型制备与分组 取雄性60只ICR小鼠。无菌条件下取接种S180瘤株6～7 d的小鼠的腹水，以生理盐水稀释，调细胞浓度至1×107个/mL。按0.2 mL每只接种于小鼠前肢右腋皮下。接种后随机分为阴性对照组、姜黄素低剂量组（10 μmol/L）、姜黄素中剂量组（20 μmol/L）、姜黄素高剂量组（40 μmol/L）、阳性对照组（CTX组），每组12只。

1.2.3 给药 接种24 h后，阴性对照组灌胃生理盐水，剂量为0.2 mL/10 g，每天1次；姜黄素低、中、高浓度组分别给予10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L， 给药剂量0.2 mL/10 g，每天1次；阳性对照组腹腔注射CTX，20 mg/kg，每天1次。观察14 d停药，称重，处死并剥离皮下瘤体称重。

1.2.4 数据收集 使用测量瘤径的方法，动态观察受试样品的抗肿瘤效应。给药前各组鼠称重（第1次），并在给药2周后分别称重，给药结束后，处死，手术剥取瘤块称重。

1.2.5 抑瘤研究 抗肿瘤活性的评价指标：肿瘤生长抑制率（%），计算公式如下：

1.2.6 荧光定量RT-PCR测定肿瘤组织中TGF-β1RⅡ、NF-κB、CyclinD1、VEGF表达的影响 （1）肿瘤组织总mRNA提取：按常规进行。（2）逆转录反应：按试剂盒说明操作进行。反应条件：37℃ 60 min，95℃ 3 min。（3）实时荧光定量PCR扩增：按试剂盒说明操作进行。反应条件：93℃→3 min变性，然后按93℃ 45 s→55℃ 60 s，共做40个循环。（4）PCR引物序列设计。

1.3 统计学处理

应用SPSS（Staffstical Package for the Social Science）19.0对结果进行统计分析，计数资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素对荷H22肝癌瘤小鼠的抑瘤作用

姜黄素低、中、高剂量组对肝癌的肿瘤抑制率分别为12.15%、36.04%、19.84%、以中剂量组抑瘤作用最好，阳性对照组的肿瘤抑制率48.99%。姜黄素低、中、高剂量组和阳性对照组与阴性对照组瘤重相比均有显著性差异（P<0.01）。结果显示姜黄素对荷H22肝癌小鼠的肿瘤生长都有明显的抑制作用，见表1，图1。

2.2 姜黄素对荷S180肉瘤小鼠的抑瘤作用

與阴性对照组比较，姜黄素对荷S180肉瘤小鼠的肿瘤生长都有明显的抑制作用，其中低、中、高剂量组的抑瘤率分别为34.13%、41.27%、22.23%，给药组以中剂量抑瘤作用最好，CTX化疗组的抑瘤率55.56%。与阴性对照组相比，姜黄素低、中剂量组瘤重，均有显著差异（P<0.05）；CTX组的瘤重有非常显著差异（P<0.01）。见表2，图1。

2.3荧光定量结果

2.3.1 TGF-β1RⅡ荧光定量结果 与阴性对照组比较，中、高剂量姜黄素组和CTX组的TGF-β1RⅡ的表达水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；低剂量组TGF-β1RⅡ的表达水平略高，但无显著性差异；与CTX化疗组比较，中、高剂量姜黄素组和CTX组的TGF-β1RⅡ表达水平显著升高。

2.3.2 NF-κB荧光定量结果 与生理盐水比较，低、中、高剂量姜黄素组和阳性对照组（CTX）NF-κB的表达水平均有明显降低，且均有显著差异（P<0.01），其中以高剂量的姜黄素组降低水平最为明显。与CTX化疗组相比，高剂量组更有明显的疗效趋势，结果有显著性差异（P<0.01）。见表4。

2.3.3 VEGF荧光定量结果 与阴性对照组比较（生理盐水），低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性对照组（CTX）VEGF的表达水平有明显降低，有统计学差异（P<0.01）；与CTX化疗组相比，高剂量组无显著性差异（P>0.05），见表5。

2.3.4 CyclinD1荧光定量结果 与阴性对照组相比，高剂量组差异非常显著（P<0.01）；与阴性对照组相比，低剂量组、中剂量组和CTX化疗组有显著差（P<0.05）。见表6。

3讨论

姜黄素是从中药姜黄、郁金、莪术、菖蒲等植物的根茎中提取的一种天然黄色酚类色素，其抗肿瘤效应近年来备受关注，有研究证实姜黄素有确切的抗肿瘤、抗氧化、抗转移、抗血管生成等作用[11]。姜黄素因其广泛的药理作用，在中国的传统医学中被广泛应用；而在现代医学中，姜黄素俨然成为研究的热点。因其诱导细胞凋亡、抑制肿瘤增殖、侵袭转移的抗癌作用和逆转耐药性，且毒副作用小、安全性高[12-16]，因此姜黄素是一种具有前景的抗癌药物，但其抗癌作用的更具体的机制需进一步研究。目前已发现姜黄素对多种恶性肿瘤如乳腺癌、宫颈癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、结肠癌、胃癌[17]等均有抑制生长的作 用，美国国立肿瘤所已将其列为第三代癌化学预防药[18，19]，但其作用机制及疗效还需进一步研究证实。大量研究证明姜黄素具有广泛的生理活性作用，不但能保护受损的正常细胞，也能抑制肿瘤细胞的增殖，在抗肿瘤药物中比较有发展前景，但其疗效因口服吸收率低而受到限制[20-21]。这就要求我们也要不断发现姜黄素中更易于吸收、更有效的成分。相信在未来的研究中，通过联合药物治疗、基因治疗、分子靶向治疗可进一步提高恶性肿瘤治疗水平。

本项目通过姜黄素干预移植瘤模型，进行体内抑瘤作用研究；采PCR检测肿瘤组织TGF-β1RⅡ、NF-κB、CyclinD1、VEGF表达的水平。本研究完成了既定的研究内容，取得了预期的研究成果：①明确姜黄素对H22肝癌、S180肉瘤荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用研究；②明确姜黄素对H22肝癌腹水瘤小鼠的生存时间的延长作用；③明确姜黄素对肿瘤组织TGF-β1RⅡ、NF-κB、CyclinD1、VEGF表达影响。

国内外在抗肿瘤药物筛选过程中通常选择各种体型实肿瘤，这类肿瘤生长速度快，增殖比率高，体积倍增时间短。肿瘤体积和肿瘤体重是评价药物抗肿瘤活性的重要指标，给药后，各组小鼠肿瘤持续增长。给药一周后给药组与CTX组比较，出现显著性差异（P<0.01）。

根据国家新药研究规定，当抑制率>30%，差异有统计学意义，则评定该受试药物有一定的抗胖瘤活性，可见，本研究的姜黄素具有良好的抗肝癌异种移植瘤活性。

肿瘤的生长过程中，机体内血液对营养的供给能力是影响肿瘤生长以及荷瘤机体维持正常生理功能的中药影响因素。红细胞是外周血中起到运送氧气和二氧化碳的作用，血红蛋白是红细胞中结合氧气和二氧化碳的活性成分，白细胞在机体中起到防御和免疫功能，淋巴细胞占白细胞的20%～30%，分为T细胞、B细胞、NK细胞等不同类型，分别起到细胞免疫和体液免疫功能，血小板在机体的炎症过程中起到一定作用。血相的变化可以在一定意义上反映机体功能是否正常。本实验后续还将进一步开展研究姜黄素对移植瘤小鼠的脾脏和血小板、血红蛋白、淋巴细胞等血细胞的影响，评价抗癌扶正协定方对机体的不良反应，此外，还从增效减毒角度探讨姜黄素是否具备逆转或缓解CTX等化疗药物的骨髓抑制，减少化疗药物对机体的损伤作用。

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（收稿日期：2016-12-06）