母婴分离应激对rd新生小鼠行为的影响

张传领， 邸 桐，王文婧，牛丽丽，肖 瑞

(1. 内蒙古医科大学药学院，呼和浩特 010110； 2. 内蒙古医科大学分子病理学重点实验室，呼和浩特 010110；3. 沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，沈阳 110016)

研究报告

母婴分离应激对rd新生小鼠行为的影响

张传领1， 邸 桐2，王文婧3，牛丽丽2，肖 瑞2

(1. 内蒙古医科大学药学院，呼和浩特 010110； 2. 内蒙古医科大学分子病理学重点实验室，呼和浩特 010110；3. 沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，沈阳 110016)

目的 rd小鼠是一种出生1周左右自发致盲的遗传性视网膜变性小鼠。通过母婴分离应激实验，检测其对rd新生小鼠的焦虑样和抑郁样行为的影响，初步评价rd小鼠能否成为眼部疾病与焦虑抑郁研究新的模型。方法 将出生第1天的rd小鼠分为母婴分离组(n=9)和对照组(n=9)。母婴分离组每天与母鼠分离4 h，共分离28 d。从第29天开始行为测试实验，通过Smart3动物行为跟踪软件检测母婴分离组和对照组在旷场实验和十字高架实验中的焦虑样行为，在强迫游泳实验和悬尾实验中的抑郁样行为。结果 在旷场实验中，母婴分离组在旷场中心的时间比例(0.88%)和运动距离(28.17±5.65)cm均明显少于对照组(2.61%，109.9±9.79 cm；P=0.04,P=0.001);在十字高架实验中，母婴分离组在开放臂的时间(40.64±4.13)s明显少于对照组(91.73±11.26 s，P<0.01); 在强迫游泳实验中，母婴分离组的不动时间(126.5±10.22)s明显多于对照组(77.75±16.83 s，P=0.02)；在悬尾实验中，母婴分离组的不动时间(21.56±6.83)s多于对照组(7.37±3.22 s，P=0.03)。 结论 rd小鼠母婴分离28 d应激，能够明显增加rd小鼠的焦虑样行为和抑郁样行为。

rd小鼠；母婴分离；开放场实验；十字高架实验；强迫游泳实验；悬尾实验

人类生活早期应激(early life stress, ELS)，是诱发焦虑、抑郁等多种精神疾病的重要风险因素。流行病学的研究结果表明那些在身体和情感上受到伤害儿童在发育过程中具有很高的焦虑障碍[1,2]和抑郁症风险[3]。ELS动物模型已经广泛的应用于研究精神类疾病机理中。动物研究显示，母婴分离导致动物行为异常而出现焦虑和抑郁样反应[4]。目前主要有两种常用的产后处理方法来模拟早期生活应激，早期剥夺(early deprivation (ED)和母子分离(maternal separation, MS)。母子分离方式包括每天将新生动物和其母亲短时间分离1 h[5, 6]和3～6 h的长时间分离[7]持续1～3周。母子分离应激在猪、豚鼠和鸟类中都有所使用，最广泛的是应用在大鼠和小鼠上。经历MS 对实验动物成年后的神经、内分泌、免疫系统以及精神行为具有广泛的影响。生命早期不良应激对神经发育的影响逐步引起关注，母婴分离逐渐成为了研究精神类疾病的有效工具，特别是研究生命早期不良应激对抑郁症的病理过程的影响正逐步成为研究热点[8]。国内外对于母子分离实验研究主要使用的正常大小鼠，极少用患有某种生理疾病的老鼠进行实验。Rd小鼠作为一种在哺乳期就因视网膜退化而失明的小鼠，在研究母婴分离应激中尚未有相关研究报道。中国是全世界盲人最多的国家，据世界卫生组织2010统计，中国盲人(blind)824.8万，低视力(low vision)6727.4万，视力残疾(visual impairment)是两者的总和7551.2万[9]。本实验试图为从小致盲人群在外界应激作用下行为变化提供基础的实验结果。为盲人抑郁症治疗和护理提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 材料

rd小鼠, rd1 (PDE6brd1; CBA/J) 小鼠购自南京大学模式生物所(动物生产许可证号：SCXK(苏)2015-0001；于内蒙古医科大学分子病理学重点实验室配种饲养,循环光照(光照12 h,黑暗12 h), 环境温度约为25℃,无菌环境下饲养。Smart3动物行为跟踪系统(Pan lab,西班牙), 敞箱(自制，边长45 cm，高50 cm)，十字高架(自制，臂长66 cm，高50 cm)，烧杯(1 000 mL)，悬尾装置(自制)，摄像机(索尼，日本)。

1.2 方法

1.2.1 母子分离应激设计：雌雄Rd成年鼠2∶1 合笼交配，待雌鼠怀孕后单笼饲养。生产后选9只新生rd鼠(5只雄性，4只雌性)实验组即母婴分离组(ms)，从出生第1天起(P1)，每天上午(9:00～13:00)与母鼠分离4 h，之后放回母鼠身边。共分离28 d。分离期间幼鼠禁食禁水。对照组新生小鼠9只不做任何处理。母婴分离应激结束后即第29天开始进行行为学测试。

1.2.2 旷场实验(open field test, OFT):将待测rd小鼠放入测试房间适应1 h，后将rd小鼠放入旷场反应箱的中央部位。用摄像机记录下rd小鼠5 min内在旷场内的活动情况。后用Smart3小动物识别跟踪系统的旷场实验模块进行跟踪分析。计算rd小鼠在测试时间内运动总路程(total distance traveled)，中央区域总路程，在中央区域(center zone)停留时间与总时间的百分比等参数。

1.2.3 十字高架迷宫测试(elevated plus-maze test，EPMT)：将待测rd小鼠放入测试房间适应1 h。后将 rd小鼠放入十字高架中心区(central area),头部面对开放臂。有摄像机记录下rd小鼠5 min内在十字高架内的活动情况，用Smart3小动物识别跟踪系统的十字高架模块进行跟踪分析rd小鼠在测试时间内进入开臂和闭臂的次数和在两臂滞留时间。

1.2.4 强迫游泳实验(forced swim test, FST):将待测rd小鼠放入测试房间适应1 h。后将 rd小鼠放入1000 mL大烧杯中，水温为26℃，水深为12 cm。有摄像机记录下6 min内rd小鼠烧杯内的活动情况， 然后用Smart3小动物识别跟踪系统的强迫游泳模块进行跟踪分析不动时间。

1.2.5 悬尾实验(tail suspension test, TST):将待测rd小鼠放入测试房间适应1 h。后将 rd小鼠尾部后2 cm处用胶带固定，悬挂于支架上，计时6 min后停止。用Smart3小动物识别跟踪系统的悬尾实验模块进行跟踪分析rd小鼠在测试时间内的不动时间进行统计。

1.2.6 数据分析:测定值用均数±标准差( Mean ±s) 表示。采用GraphPad Prism 6软件分析，组间比较采用t检验。以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 旷场实验

母婴分离组(MS)组平均总运动路程为2106±249.7 cm对照组(control)平均总运动路程为2797±211.9 cm。母子分离组走过的总路程比对照组短，两组统计学上差异有显著性(P=0.049)。MS组和对照组在周围区域运动路程分别为(2077±247.4) cm和(2687±206.0) cm，两组统计学上差异没有显著性(P=0.074)。而在中间区域运动路程两组差异有非常显著性(P<0.0001)，MS组的平均运动距离为28.17±5.65 cm，而对照组在中间区域的平均运动距离为(109.9±9.79) cm(图1)。从小鼠在中间区域停留时间占总时间的百分比看， MS组为0.88%，对照组为2.61%，两组差别有显著性(P=0.0015)(图2)。

2.2 十字高架实验

在rd小鼠进入开放臂次数方面， MS组(13.80±2.51)次与对照组(12.20±1.11)次差异没有显著性(P=0.78)(图3)。而rd小鼠在开放臂的时间来看，ms组(40.64±4.13)s明显少于对照组(91.73±11.26)s(图4)。

2.3 强迫游泳

母婴分离组在强迫游泳实验中的平均不动时间为(126.5±10.22) s，对照组为(77.75±16.83) s，母婴分离组明显多于实验组(P=0.02)(图5)。

2.4 悬尾实验

母婴分离组在强迫游泳实验中的平均不动时间为(21.56±6.83) s，对照组为(7.37±3.22) s，母婴分离组明显多于实验组(P=0.03)(图6)。

图1 rd小鼠在开放场中的运动距离比较Fig.1 Traveled distance of rd mice in open field test

图2 母婴分离组(MS)与对照组(control)在开放场中心区停留时间比例Fig.2 Time ratio of center zone vs total zone of the two groups mice in open field test

图3 母婴分离组(MS)与对照组(control)小鼠在十字高架中进入开放臂次数Fig.3 Entries in the open arms between MS and control groups

图4 母婴分离组(MS)与对照组(control)小鼠在开放臂停留时间Fig.4 Time in open arms between the MS and control groups

图5 母婴分离组(MS)与对照组(control)强迫游泳中不动时间Fig.5 Immobility time between the MS and control groups in force swim test

图6 实验组(MS)与对照组(control)在悬尾实验中不动时间Fig.6 Immobility time between the MS and control groups in tail suspend test

3 讨论

旷场实验又称敞箱实验，是测试啮齿类动物焦虑样行为的常用的方法，旷场区域要比鼠笼大很多，啮齿类动物天生倾向于靠近有壁的地方活动，而避免在中心不可预测的地方活动。测量它们在中心区域的探究行为是和焦虑相关的的指标[10,11]。本实验在rd小鼠在周边路程在没有显著性差异情况下，停留在中心区域的的时间，中心区域运动距离和总运动距离母婴分离组明显少于对照组，从开放场结果看，rd小鼠母婴分离后焦虑样行为更明显。

十字高架实验是评估啮齿类动物焦虑样反应的很受欢迎的方法。十字高架有一对闭合臂和一对开放臂构成，高架离地面50 cm，实验利用小鼠对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧形成矛盾冲突来考察小鼠的焦虑状态。用小鼠在开放臂的次数和时间来衡量其焦虑状态[12,13]。本实验结果表明，母子分离组进入开放臂的时间要比对照组要少，说明母子分离让rd小鼠比正常组小鼠表现出更多的焦虑样行为。

强迫游泳实验是进行抗抑郁药初步筛选和判断啮齿类动物抑郁样行为的有效的测试实验，实验将实验对象放到灌水的圆柱体中，造成不可逃脱的环境，以测试时间内啮齿类动物不动时间作为指标[14]。本实验在强迫游泳的结果中显示母子分离rd小鼠28 d，增加了rd小鼠的抑郁样行为。

悬尾实验是基于小鼠被悬尾后，在一种短期的无法逃脱的有害环境中，产生绝望，表现出静止不动。该实验用于评估小鼠的抑郁样行为[15,16]。本实验结果显示母子分离组rd小鼠较对照组抑郁样行为明显增加。

临床和流行病学调查显示失明和眼部疾病与抑郁症和焦虑有广泛的联系[17,18]。如何进行动物学实验方面的研究一直没有合适的动物品系。Rd小鼠具有视网膜变性基因病变，在出生后第7天左右视网膜退化导致小鼠失明。而国内外关于母子分离实验选取生理正常的大小鼠进行，其结果在不同品种大小鼠之间结果也缺乏稳定的一致性[19]。本实验结果显示遗传性致盲小鼠在母子分离应激中也表现出更高的焦虑样和抑郁样行为。rd小鼠能否成为研究眼部疾病与焦虑和抑郁的新的动物模型，需要在机制上进一步在研究。

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Effect of maternal separation stress on behavior of neonatal rd mice

ZHANG Chuan-ling1, DI Tong2, WANG Wen-jing3, NIU Li-li2, XIAO Rui2

(1. School of Pharmacy, Inner Mongolian Medical University, Huhhot 010110，China;2. Key Laboratory of Molecular Pathology, Inner Mongolian Medical University, Huhhot 010059；3. School of Life Sciences and Biopharmaceutics; Shenyang Pharmaceutical University; Shenyang 110016)

Objective To evaluate the effect of maternal separation stress on the behavior of neonatal rd mice. Methods Neonatal rd mice were divided into maternal separation (MS) group (n=9) and control group (n=9). MS-stress was induced in the MS group by 4-hour-separation per day for 28 days. Open field test, elevated plus maze test, forced swim test and tail suspension test were used to evaluate the anxiety-like and depression-like behavior of the neonatal rd mice.Results The stay time and distance travelled of MS group in the central zone were 0.88% and 28.17±5.65 cm, respectively, significantly shorter than that of the control group (2.61%，109.9±9.79 cm.P=0.04,P=0.001). Compared with the control group, the stay time in open arms of the MS group was significantly decreased (P<0.01), while the immobility time in forced swim test and tail suspension test of the MS group were 126.5±10.22 s and 21.56±6.83 s, significantly longer than that of the control group (77.75±16.83 s,P=0.02, 7.37±3.22 s,P=0.03). Conclutions The 28-day maternal separation stress can significantly increase the anxiety-like and depression-like behavior in neonatal rd mice.

rd mice, neonatal; Maternal separation; Stress; Open field test; Elevated plus maze test; Force swim test; Tail suspension test; Anxiety-like behavior; Depression-like behavior

国家自然科学基金(编号31260260),内蒙古医科大学博士启动基金(编号：nybq2010zcl)。

张传领(1978-),男，博士,讲师,主要研究方向：民族药学,神经药理。

肖瑞(1979-),女，博士,教授,主要研究方向：分子病理,神经退行性疾病，E-mail:xiaorui79@hotmail.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0089-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.015

2016-11-28