视黄醛脱氢酶1在胆囊癌中的表达及其临床意义

黄海林，陈 超，甘 泉，杜哲明

视黄醛脱氢酶1在胆囊癌中的表达及其临床意义

黄海林，陈 超，甘 泉，杜哲明

目的 观察视黄醛脱氢酶1(retinal dehydrogenase 1，ALDH1A1 )在胆囊癌组织中的表达及其临床意义。方法 采用组织芯片技术和免疫组织化学方法检测59例胆囊癌组织标本，7例癌旁组织标本及6例慢性胆囊炎组织标本中ALDH1A1表达情况。结果 ALDH1A1在6例慢性胆囊炎和7例癌旁组织中全部阳性表达，在59例胆囊癌组织中，ALDH1A1表达率为62.7%(37/59)，慢性胆囊炎、癌旁组织与胆囊癌组织中ALDH1A1表达差异有统计学意义(P<0.05)。ALDH1A1与疾病进展和组织分化呈负相关，表达差异有统计学意义(P<0.05)。结论 胆囊癌组织中ALDH1A1蛋白的表达与疾病进展和组织分化呈负相关。

胆囊癌；组织芯片技术；视黄醛脱氢酶1

胆囊癌是相对罕见的疾病，在胃肠道肿瘤中仅占4%，限于黏膜层的肿瘤5年生存率为32%，而进展期的肿瘤1年生存率只有10%[1-4]。目前腹腔镜胆囊切除术(laparoscopic cholecystectomy, LC)是胆囊炎治疗的金标准，超过80%的胆囊炎通过LC治疗，因此，意外胆囊癌的机会大大增加。0.3%～1.0%的LC患者通过术后病理诊断为胆囊癌[5-7]，单纯性胆囊切除在T1a期肿瘤足够，但是对于T1b期肿瘤及T2期肿瘤，应选择二次手术。胆囊癌缺乏有效的诊断指标，以至使临床医师非常困惑。本研究通过组织芯片技术和免疫组织化学方法检测，在蛋白组学中寻找胆囊癌组织差异表达蛋白ALDH1A1的表达情况，并探讨其与肿瘤临床病理间的关系。

1 材料与方法

1.1 标本 收集2004-01至2007-12上海长征医院及武警江西总队医院存档的59例胆囊癌石蜡标本。男21例，女38例。<60岁21例，≥60岁37例，1例年龄缺失，平均年龄61.5岁。病理诊断结果经两名以上病理医师确认。腺癌54例，其他5例(腺鳞癌4例，未分化癌1例)，其中有淋巴结转移12例，肝脏侵犯13例。临床分期采用胆囊癌Nevin分期(1976)，其中54例具有明确的Nevin分期：Ⅰ期(癌组织仅限于黏膜内，即原位癌)2例，占3.70%；Ⅱ期(侵及肌层)7例，占12.96%；Ⅲ期(癌组织侵及胆囊壁全层)21例，占38.89%；Ⅳ期(侵及胆囊壁全层合并周围淋巴结转移)7例，占12.96%；Ⅴ期(直接侵及肝脏或转移至其他脏器或远处转移)17例，占31.48%。随机选取其中7例癌旁组织(离胆囊癌边缘0.5 cm以上)。另外6例慢性胆囊炎标本为上海第二军医大学尸检标本。

1.2 试剂与仪器 组织芯片构建仪(Tissue Arrayer)，购自美国BEECHER，INSTRUMENTS公司。兔抗ALDH1A1多克隆抗体(AP1445a)购自美国ABGENT公司； EnVision免疫组化试剂盒购自丹麦Dako公司；DAB显色液配制：取DAB 5 mg溶于100 ml 0.05 mol/L Tris-HCl(pH 7.6)中，加入30%H2O210 μl，搅拌混匀后过滤(使用前配制)。

1.3 组织芯片制作 观察并根据HE切片确定具有代表性的病变部位(癌和癌旁)，加以标记；制作大小45 mm×20 mm×20 mm的空白蜡块；利用Tissue Arrayer在空白蜡块中打孔(直径2 mm)，而后在选取的组织蜡块中穿取标记组织(直径2 mm)，准确放入空白蜡块的小孔中；按序依次操作，直至将所有所需组织标本种植于此空白蜡块中，制作成组织芯片蜡块；应用石蜡切片机进行连续切片，贴附于防蜡的载玻片上备用。

1.4 免疫组织化学染色 采用SP法，ALDH1A1工作浓度为稀释比例1∶100；按试剂盒说明书进行操作，DBA显色，苏木精复染后中性树胶封片，以PBS代替一抗为阴性对照。

1.5 结果判定 显微镜下观察，在良好的组织结构及清晰的背景上细胞内出现棕黄色颗粒为阳性，采用二级计分法：0分，阳性细胞计数<5%；1分，阳性细胞计数5%～<25%；2分，阳性细胞计数25%～<50%；3分，阳性细胞计数50%～<75%；4分，阳性细胞计数≥75%。染色强度分类：1分，淡黄色；2分，黄或深黄色；3分，褐或棕褐色。两者计分相乘大于1者为阳性。

1.6 统计学处理 使用SPSS11.0软件包进行数据处理。计数资料采用绝对数和率表示，组间率的比较采用χ2检验、四格表精确概率法分析，相关性分析用Pearson相关检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 构建1张组织芯片 成功制备1张胆囊癌组织芯片，含133个位点，共有4个点组织脱落，用普通切片补充，其余位点组织结构保存良好。

2.2 ALDH1A1在慢性胆囊炎、癌旁、胆囊癌组织中的表达 ALDH1A1蛋白阳性着色定位于细胞浆内，淡黄、棕黄或棕褐色(图1)。ALDH1A1在6例慢性胆囊炎和7例癌旁组织中全部阳性表达，在59例胆囊癌组织中，ALDH1A1表达率为62.7%(37/59)，慢性胆囊炎、癌旁组织与胆囊癌组织中ALDH1A1表达差异有统计学意义(χ2=3.84，P<0.05)。

2.3 ALDH1A1表达与肿瘤生物学行为的关系 ALDH1A1与疾病进展和组织分化呈负相关，表达差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

图1 ALDH1A1蛋白在慢性胆囊炎、癌旁组织及胆囊癌组织的表达情况(SP,×200)

A、B. 慢性胆囊炎并胆囊结石及癌旁组织中ALDH1A1蛋白高表达; C、D、E. 胆囊癌组织标本中ALDH1A1蛋白不表达或低表达

表1 ALDH1A1表达与肿瘤生物学行为的关系

3 讨 论

组织芯片技术在肿瘤核酸、蛋白检测中的应用，以及这种技术与基因芯片、蛋白芯片等其他生物学技术的结合应用，极大地丰富并促进了肿瘤的基础性研究。应用该技术可快速、高效、经济、简便地进行大样本高通量检测，同时避免了操作及统计中造成的误差，较好的克服了人为因素带来的偏差。

视黄醛是视网膜上光感受器中视紫红质的重要组分，视黄醛可被ALDH1A1氧化成具有转录调节活性的维A酸。本研究表明，ALDH1A1蛋白在6例慢性胆囊炎和7例癌旁组织中全部阳性表达，而在59例胆囊癌组织中，ALDH1A1的表达率分别为62.7%(37/59)。在研究ALDH1A1与胆囊癌临床病理联系时发现ALDH1A1与胆囊癌的Nevin分期和组织分化呈负相关。笔者在检索关于ALDH1A1蛋白的文献时发现无相关报道。可以推断，当体内缺乏ALDH1A1时，维A酸产生减少，而维A酸是维生素A在体内的活性代谢产物。维A酸在胚胎及成年组织中有多种生物学活性，如在细胞增生、凋亡、分化、生殖、维持细胞正常功能等方面发挥重要作用。作为一种抗肿瘤药维A酸已成功用于肺、肝、皮肤、膀胱和乳腺肿瘤动物模型，并作为急性早幼粒细胞白血病(APL)的治疗药物应用于临床[8，9]。Manicassamy等[10]发现，维A酸可以抑制胃癌细胞生长，研究者采用不同浓度水平的维A酸作用于体外培养的胃癌细胞，并采取了不同时段的荧光显微镜观察。他们发现，较低浓度水平的维A酸对细胞无明显的抑制作用，而中等浓度水平(10～20 μl)可明显抑制胃癌细胞的生长，且随着作用浓度和作用时间的增加，其抑制作用增强。Markert等[11]发现，结肠腺瘤性息肉病(APC)肿瘤抑制基因通过调节维生素A向维A酸的转化发挥了其控制作用。

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(2016-11-10收稿 2017-01-21修回)

(责任编辑 武建虎)

Expression and clinical significance of retinal dehydrogenase 1(ALDH1A1 )in gallbladder carcinoma by tissue microarray

HUANG Hailin, CHEN Chao, GAN Quan, and DU Zheming.

Department of General Surgery, Hospital of Jiangxi Provincial Corps, China People’s Armed Police Force, Nanchang 330030, China

Objective To explore the expression and clinical significance of retinal dehydrogenase 1(ALDH1A1) in gallbladder carcinoma.Methods The expressions of ALDH1A1 were detected in 59 specimens of gallbladder carcinoma tissues，7 specimens of adjacent non-tumor tissues and 6 specimens of chronic cholecystitis tissues by tissue microarray technique and immunohistochemistry.Results In 7 specimens of adjacent non-tumor tissues and 6 specimens of chronic cholecystitis tissues, there was a positive expression of ALDH1A1. The expression of ALDH1A1 was not detected or weakly positive in 59 gallbladder carcinoma tissue specimens and the positive rate was 62.7%(37/59). The positive rate of ALDH1A1 in tissue specimens of gallbladder carcinoma was significantly lower than the expression in the adjacent non-tumor tissues or chronic cholecystitis tissues(P<0.05). ALDH1A1 was negatively correlated with disease progression and tissue differentiation, and there was significant difference in levels of expression (P<0.05).Conclusions The expression of ALDH1A1 in gallbladder carcinoma tissues is negatively correlated with the progression of disease and tissue differentiation.

gallbladder carcinoma; tissue microarray technique; ALDH1A1

黄海林，博士，副主任医师。

330030 南昌，武警江西总队医院外一科

R735.8