一株苯胺降解菌的筛选及其降解效率研究

刁 刻，吴 琼，邱业先

（苏州科技大学 化学生物与材料工程学院，江苏 苏州 215009）

一株苯胺降解菌的筛选及其降解效率研究

刁 刻，吴 琼，邱业先*

（苏州科技大学 化学生物与材料工程学院，江苏 苏州 215009）

从活性污泥中筛选出一株可高效降解苯胺的细菌，通过扫描电镜观察、PCR法扩增16S rDNA测序和比对、生理生化实验鉴定其种属。结果显示，所筛选的菌株DK为代尔夫特菌属（Delftia sp.）。通过正交试验探索其最优生长条件为：温度30℃，pH=8，摇床转速250 min-1，苯胺浓度0 mg·L-1。菌株DK对苯胺降解效率随着接种量增加而提高，随着苯胺浓度的增加而减小。菌株DK在含有1 000 mg·L-1苯胺的自来水中3 d后的降解率达到87.4%。为菌株DK的开发应用奠定了一定基础。

苯胺；降解；代尔夫特菌属；16S rDNA

苯胺属于芳香胺类化合物，我国苯胺年生产能力达到两百万吨，广泛应用于印染等化工领域。值得注意的是，苯胺已对人类和环境造成严重危害，被美国EPA列为优先控制的129种污染物之一[1]。因此，环境中苯胺降解得到越来越多的关注。微生物降解法因其具有成本较低、无二次污染等优点，成为降解苯胺研究的热点和重点。目前，国内外苯胺降解研究主要集中在高效降解菌筛选和其降解性能等方面[2-4]。笔者从污水处理厂（主要为有机物降解）的活性污泥中筛选到1株以苯胺为唯一碳、氮源生长的细菌，并对其进行生物学鉴定和降解性能研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

活性污泥取自苏州某污水处理厂曝气池中；DNA提取试剂盒购自于上海（生工）生物工程公司；Taq酶购自北京康为世纪生物公司；16S rDNA通用引物由上海（生工）生物工程公司合成；其他所用试剂为国产分析纯。

1.1.2 仪器

9700型PCR购自美国AB公司；5417R冷冻离心机购自美国Eppondorf公司；DKY恒温调速回转式摇床购自上海杜科；水浴锅、GNP9050隔水式恒温培养箱购自上海精宏；SW-CJ-2FD超净工作台购自上海博讯实业；TU1810紫外/分光光度计购自北京普析；ATB1525半自动细菌检定仪购自法国梅里埃集团公司；Philip XL20扫描电子显微镜购自荷兰飞利浦公司。

1.1.3 培养基[5]

富集培养基（w/v）：葡萄糖0.1%，蛋白胨0.05%，氯化钠0.5%，磷酸氢二钾0.5%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.05%，调pH值至7.0；无机盐培养基（w/v）:磷酸二氢钠0.05%，磷酸氢二钾0.05%，硫酸镁0.05%，氯化钙0.01%，调pH值至7.0。以上培养基均在121℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌种的驯化和筛选

取1 mL活性污泥加入苯胺富集培养基（苯胺浓度500 mg·L-1），摇床培养（30℃、160 min-1），12 h后待培养基浑浊，接种到含600 mg·L-1苯胺的富集培养基，连续多次转接，直至接种到含1 000 mg·L-1苯胺的富集培养基中。随后，转接到含1 000 mg·L-1苯胺的无机盐培养基中，摇床培养3 d，并在含1 000 mg·L-1苯胺的无机盐培养基，重复转接培养3次，确保菌株对苯胺的耐受性不变。最后，将所得菌液涂平板，划线分离纯化菌种，挑选单菌落纯化培养，并测定每个培养试管中的苯胺降解率，选择出降解率最高的一组，所筛选得到的菌株编号为DK。

1.2.2 菌株DK的生长条件测定

以LB培养基为基础培养基，设计菌株DK生长条件的正交试验。通过正交试验设计，测定菌株DK培养液2 d后的OD600来探究温度、pH值、摇床转速、苯胺的含量以考察这四个因素对菌株DK生长的影响。水平条件设计因素位级表见表1，正交实验表见表2。

表1 正交实验因素位级表

表1 正交实验表

1.2.3 菌种DK的观察及鉴定

菌落的观察以及细菌鉴定仪鉴定：在无机盐培养基中，菌株DK培养60 h后，取100 μL菌液均匀涂于固体培养基 （苯胺含量为1 000 mg·L-1），放入恒温培养箱中，待菌落长出，观察菌落形态。挑取单菌落用于革兰氏鉴定和半自动细菌检定仪进行生理生化鉴定。

扫描电镜的观察：接种菌液到新的LB培养基中，过夜培养得到新鲜的菌液。第一步，取一定量的培养液于8 000 rpm离心机离心4 min，弃上清液，并加入固定液2.5%的戊二醛。第二步，固定，脱水。在固定液戊二醛中浸泡4 h左右，并用磷酸缓冲液冲洗3次，脱水用乙醇梯度分别为30%、50%、75%、85%、95%的乙醇脱水。每个梯度乙醇脱水一次。最后用无水乙醇脱水2次。每次脱水时间大约在20 min。完成后再用乙酸异戊酯置换2次，每次20 min。之后样品送到苏大扫描电镜实验室进行电镜观察。

16S rDNA序列的测定：收集菌体，提取染色体总DNA作为扩增模板。16S rDNA扩增的PCR反应所用的引物两端序列分别是27F和1492R，5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和5’-GGTTACCTTGTTCGACTT-3’。PCR反应体系 （25 μL）为10×PCR缓冲液2.5 μL，dNTP 2.5 μL，引物0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，Taq酶0.2 μL，加双蒸水至25 μL。PCR反应程序如下：94℃预变性 4 min，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，此步骤共进行 30个循环，72℃延伸10 min，4℃终止反应。产物进行电泳检测，纯化回收，由上海生工测序部测序。

1.2.4 苯胺含量的测定

苯胺含量测定采用国标法GB/T11889-1989[6]，按下式计算结果

降解率（%）=（对照样品苯胺含量-所测样品苯胺含量）/对照样品苯胺含量×100%

1.2.5 接种量、苯胺浓度对菌株DK降解率的影响

以无机盐培养基中培养生长60 h的菌液为接种液，按照0.5%、1%、2%、4%不同接种量接入到苯胺浓度为1 000 mg·L-1的无机盐培养基；以1%接种量分别接入苯胺浓度依次为300、500、700、900、1 100 mg·L-1的无机盐培养基。测定苯胺降解率。

1.2.6 不同水体环境中苯胺降解率变化

以1%的接种量转接菌株DK至超纯水、自来水、湖水中，水样中苯胺含量均为1 000 mg·L-1，测定3 d后苯胺的降解率。

2 结果与讨论

2.1 菌株DK的筛选和鉴定

经过富集培养、无机盐培养基驯化筛选、涂平板分离、降解率测定筛选以及划线分离纯化，得到高效降解苯胺的纯化菌种，命名为DK。该菌的菌落较小，圆形中间有凸起，边缘较为整齐，表面颜色为淡黄色。革兰氏镜检为阴性。

菌株DK扫描电镜照片图（如图1所示），图中显示出菌株DK的立体形态，外形大多呈杆状。长度在3 μm左右，宽度小于0.5 μm。菌与菌之间已发生交联。

生理生化鉴定结果（见表3）显示与细菌检定仪收录的细菌库中代尔夫特食酸菌 （Delftia acidovorans）相似性达到85.9%，可以认定DK属于代尔夫特菌属（Delftia sp.）。

图1 菌株DK的SEM扫描电镜照片

表3 生理生化反应结果

通过16s rDNA序列在NCBI blast的对比鉴定，发现其16S rDNA序列与多个代尔夫特菌属细菌相似度达到99%以上。 用MEGA 4构建分子进化树，采用Neighbor Joining法建树，用Bootstrap进行检验，并重复1 000次。则确定菌种DK属于代尔夫特菌属（Delftia sp.）。测定16S rDNA序列（序列在GenBank的登录号为R30W4Z22014）以及基于16S rDNA序列的分子系统发育树（如图2所示）结果如下：

图2 基于16S rDNA序列系统发育树

2.2 菌株DK的最佳生长条件

设计正交实验研究温度、培养基pH值、摇床转速和苯胺浓度对菌株DK的生长的影响，得出菌株DK在LB培养基中生长的最优条件。结果见表4。其中，温度、pH值、摇床转速和苯胺浓度4个影响因素的极差R分别为：0.197、1.520、0.213、0.189。由此得出4个影响因素对菌株DK生长的影响大小依次为：pH值＞摇床转速＞温度＞苯胺浓度。

由表4结果可知，pH值是影响菌株DK生长最重要的因素。pH值为6和8的六个组的菌株生长情况明显好于其他三个组，OD600值最高达到2.023，总体来说pH值为8的三组之和要大于其他两组，最差的是pH值为4的实验组，OD600值最高只达到0.169。可见菌株DK比较适宜生长在中性或者偏弱碱性的环境中。另一方面，在菌株DK的初始筛选过程中，所用的富集培养基和选择培养基的pH值都为7左右。

表4 正交试验结果表

摇床转速是影响菌株DK生长的次要因素，对菌株DK生长的影响较为重要。较高的摇床转速首先可以为微生物生长的体系提供充足的供氧，其次也可以提高微生物对体系中碳源、能源及其他营养元素的接触率，从而提高对它们的利用率，促进微生物的生长，这些可能是摇床转速增加后OD600也有较大增加的原因。另一方面，菌株DK是从曝气池中的活性污泥中筛选得到的，其中的绝大数微生物是好氧菌。

温度影响菌株DK生长的效果又略低于摇床转速。温度通过影响细胞酶的活性而影响微生物自身的代谢活动及细胞中生化反应的速率，温度过低会抑制菌株的生长和酶的活性，温度过高会使机体自身的蛋白质、核酸等重要组成部分受到不可逆的破坏，因此，只有适宜的温度能加快微生物的生长繁殖速率，增加酶的产量，提高酶的活性，进而增强微生物降解能力。从正交实验结果来看，菌株DK在30℃条件下的生长情况要好于25℃和35℃条件下的生长情况。

苯胺浓度影响效果在四者之中最小，但从表4中可以看出苯胺浓度增大，菌株DK的生长量降低。苯胺作为环境中一种有毒物质，对一般的微生物生长都有较大抑制作用。但笔者筛选得到的菌株DK可把苯胺作为唯一碳源、氮源来进行降解利用，所以苯胺对其抑制作用很小。

综上所述，分析每个因素在LB培养基生长状况的影响，并结合实际情况可以确定菌株最优生长条件为温度30℃，pH=8，摇床转速250 min-1，苯胺浓度0 mg·L-1。

2.3 接种量、苯胺浓度和水体环境对菌株DK降解率的影响

2.3.1 接种量对菌株DK降解率的影响

在0.5%、1%、2%、4%不同接种量的条件下，测定无机盐培养基中苯胺（浓度为1 000 mg·L-1）不同时间段的降解率，结果显示随着接种量的增加，完全降解苯胺所需时间减少（如图3所示）。但是从实际情况出发1%的接种量满足降解效率要求，且可以降低成本。

图3 不同接种量对苯胺降解率的影响

2.3.2 苯胺浓度对菌株DK降解率的影响

分别在苯胺浓度为 300、500、700、900、1 100 mg·L-1的无机盐培养基下，以1%菌液接种量接入培养基中，测定不同时段的降解率，结果（图4）显示低浓度苯胺条件下菌株DK对苯胺降解较快，高浓度时降解较慢。说明苯胺不仅是该菌株的碳、氮源，高浓度苯胺也会抑制菌株的生长，从而使降解率变低。

2.3.3 不同水体环境对菌株DK降解率的影响

在超纯水、自来水和湖水等的水体中菌株DK对苯胺的降解率分别为10.1%、87.4%和57.4%。这一结果说明，在自来水中的降解效果最好，超纯水中降解效果最差（如图5所示）。自来水含有一定的离子浓度，且所含的其他杂质和杂菌也较少，从而有利于菌株的生长，这可能是菌株DK在自来水中降解率较高的原因。

图4 不同的苯胺底物浓度对降解率的影响

图5 不同水体环境中的苯胺降解情况

3 结语

（1）取自污水处理厂曝气池的活性污泥样品，经过富集培养、无机盐培养基驯化培养筛选，涂平板分离，再经降解率测定筛选以及划线分离纯化，得到降解苯胺达87.4%的高效降解苯胺的菌株，命名为DK。

（2）筛选出来的苯胺降解菌株DK具有菌落小、圆形中间突起、边缘整齐、表面颜色为淡黄色的培养特征。电镜观察显示该菌呈杆状，长度3 μm左右，宽度小于0.5 μm，菌间发生交联。

（3）对DK菌株进行革兰氏染色鉴定为阴性细菌。经法国梅里埃公司生产的细菌鉴定仪所做的生理生化鉴定，该菌为代尔夫特菌属（Delftia sp.）。16S rDNA序列比对鉴定，该菌也为代尔夫特菌属（Delftia sp.）。查阅国内外资料，已有报道分离的苯胺降解菌有 Alcaligenes faecalis、Nocardia sp.、Rhodococcus erythropolis、Hodococcus sp.、Frateuria sp.、Pseudomonas putida、Pseudomonas sp.、Pseudomonas acidovorans、Achromobacter sp.和Acinetobacter sp.等，笔者分离的菌株DK没有被报道过，属于新的菌种。与现有报道的苯胺降解菌的苯胺降解率比较，李岩等[7]报道的菌株Ani-4-15和菌株Ani-5-61降解率达到85%和70%。Shan Dan[8]报道的菌株JH-9降解率达到74%。Wang Dianzhan等[9]分离出热带假丝酵母AN1苯胺降解率达到93%。谢青等[10]报道的菌株AN-6降解率达到95%以上。笔者分离的降解菌DK苯胺的降解率达87.4%，处于中等水平，具有一定的开发利用价值。

（4）以正交试验研究了温度、pH值、摇床转速和苯胺浓度对菌株DK生长的影响，结果表明：DK菌株的最佳生长温度30℃，最佳生长pH值为8，最佳摇床转速为250 min-1，最佳生长苯胺浓度为0 mg·L-1。对温度、pH值、摇床转速和苯胺浓度四个生长因素试验结果极差分析，极差R值分别为0.197、1.520、0.213、0.189。由此得出4个影响因素对菌株DK生长的影响大小依次为：pH值＞摇床转速＞温度＞苯胺浓度。

（5）研究结果还揭示，菌株DK对苯胺降解效率随着接种量的增加而增加，随着苯胺浓度的增加而减少。DK在超纯水、自来水和湖水中的苯胺降解率为10.1%、87.4%和57.4%，说明自来水有益于苯胺的降解。

总之，笔者从活性污泥中分离了一株可有效降解苯胺的菌株，经鉴定为代尔夫特菌属（Delftia sp.），进而，研究了该菌的最佳生长条件，揭示了该菌降解苯胺的影响因素，为该菌用于污水处理及土壤修复打下了一定基础。

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[9]WANG Dianzhan，ZHENG Guanyu，WANG Shimei.Biodegradation of aniline by candida tropicalis AN1 isolated from aerobic granular sludge[J]. Journal of Environmental Sciences，2011，23（12）：2063-2068.

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Isolation and effect of an aniline-degrading bacterium named DK

DIAO Ke，WU Qiong，QIU Yexian
（School of Chemistry，Biology and Materials Engineering，SUST，Suzhou 215009，China）

One efficient aniline-degrading bacterium named DK was isolated from activated sludge.DK was observed through the SEM.16S rDNA of DK was amplified using PCR；then species were identified by sequencing and alignment.The optimal growth conditions of DK were measured through orthogonal experiments.The result showed that the screened bacterium DK belonged to Delftia sp..The optimal growth conditions were that the temperature was 30℃；pH was 8；rotation speed was 250 min-1and aniline concentration was 0 mg·L-1.The degradation rate of aniline in tap water was 87.4%in three days by stain DK,and the concentration of aniline in tap water was 1 000 mg·L-1.This study provided a theoretical basis for the large-scale application of DK.

aniline；degradation；Delftia sp.；16S rDNA

责任编辑：李文杰

X172

：A

：2096－3289（2017）02－0043－06

2015－05－20

江苏省科技支撑项目（BE201038）

刁 刻（1990-），男，安徽宿州人，硕士研究生，研究方向：环境有益微生物研究与利用。*

邱业先（1954-），男，博士，教授，博士生导师，E-mail：qyx542@163.com。