Gab2对结肠癌细胞MMP合成的影响

刘玉辉，孙庆庆，郭放，刘军灵

（沈阳军区总医院肿瘤科，沈阳110006）

Gab2对结肠癌细胞MMP合成的影响

刘玉辉，孙庆庆，郭放，刘军灵

（沈阳军区总医院肿瘤科，沈阳110006）

目的：探讨Gab2对结肠癌细胞MMP合成的影响。方法：临床选择2015年7月～2016年4月本院收治的接受手术的结肠癌病人的临床病理资料及组织标本，应用Western blot法检测接头蛋白Gab2水平，分析接头蛋白Gab2对结肠癌细胞侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9合成的影响。结果：结肠癌接头蛋白Gab2的阳性表达与病人的性别、年龄等临床指标无相关性，而与结肠癌的是否发生远处转移、肿瘤直径大小等临床指标密切相关，差异有统计学意义；接头蛋白Gab2阳性组的MMP-9、MMP-2指标水平显著高于Gab2阴性组，差异有统计学意义。结论：接头蛋白Gab2可通过影响结肠癌细胞MMP-9、MMP-2的表达进而影响结肠癌细胞的转移侵袭。

MMP-2；细胞侵袭转移；结肠癌细胞；Gab2

结肠癌是临床常见的恶性肿瘤类型之一，近年来其发病率逐年呈升高趋势，相关研究表明，结肠癌的癌细胞的转移侵袭与接头蛋白Gab2的表达对结肠癌细胞MMP合成的影响密切相关［1］。在细胞信号传导过程中，接头蛋白起到连接信号蛋白的作用，接头蛋白具有SH3 及SH2结构域，其中SH2结构域可结合上游信号蛋白的磷酸化的酪氨酸残基，而SH3结构域可特异性结合下游信号蛋白含有脯氨酸的结构域，通过接头蛋白的连接，实现上下游信号蛋白的信号传递［2］。探析接头蛋白Gab2对结肠癌细胞MMP合成的影响十分重要，故临床选择2015年7月～2016年4月本院收治的接受手术的结肠癌病人的临床病理资料及组织标本，应用Western blot法检测接头蛋白Gab2水平，分析接头蛋白Gab2对结肠癌细胞侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9合成的影响，效果满意，详见以下报道：

1 资料与方法

1.1 一般资料 临床选择 90例于2015年7月～2016 年4月期间本院收治的结肠癌病人的临床病理资料及组织标本。全部病人均经病理学检测且明确诊断，其中男性50例，女性40例，年龄37-75岁，平均年龄（50.3 ±1.3）岁；中科院上海细胞库提供人结肠癌HCT116细胞，GIBICO公司提供青链霉素、胰蛋白酶、胎牛血清、PRM1640培养基；SIGMA公司提供抗人Gab2、抗人MMP-9、抗人MMP-2等相关一抗；上海生工公司提供SiRNA公司。纳入标准：符合中华医学会肿瘤疾病科学会制定的结肠癌的诊断标准［3］；接受手术治疗者；预计生存期超过3个月、术前未接受其他抗癌治疗；排除标准：无法配合相关指标检查及治疗者；哺乳期或妊娠期女性；合并严重的血液系统疾病和严重心肺肝肾功能障碍者。

1.2 方法 结肠癌组织留取后均立即进行免疫组化检测，检测组织中的接头蛋白Gab2表达情况；应用PRM1640培养基以7：1的比例稀释matrigel，每个小室加入100ul；胶凝固后每孔加入20000个细胞，分为Gab2沉默组及对照组，24h后应用结晶紫染色观察细胞的迁移能力；在孔板底应用200ul枪头在生长均匀的细胞层划十字形划痕，12h后观察细胞的迁移能力；Westernblot：在10cm培养皿内接种对数生长期的结肠癌细胞株HCT116细胞，分为Gab2沉默组及对照组，待细胞生长24h后收取细胞，RIPA裂解缓冲液进行裂解，BCA法检测蛋白浓度；取等量的蛋白加入loading buffer煮沸10min，后予以SDS-PAGE凝胶电泳；在PVDF膜内转膜且5%脱脂奶粉封闭1h；依次加入相应一抗（MMP-9、MMP-2）和二抗孵育，后加入ECL发光液进行检测。评估不同年龄、性别、肿瘤直径、是否发生远处转移的结肠癌患者的临床资料与接头蛋白Gab2的表达情况的相关性；评估接头蛋白Gab2阳性组与Gab2阴性组的MMP-9、MMP-2水平的表达情况。

1.3 统计学处理分析 采用SPSS19.0 统计学软件进行数据分析。采用mean±SD表示计量资料，进行t 检验，P＜0.05为差异有统计学意义。对结肠癌接头蛋白Gab2阳性表达的相关影响因素进行Logistic回归分析，以P＜0.05作为逐步回归筛选变量的标准。

2 结果

2.1 结肠癌病人的临床病理参数指标与接头蛋白Gab2的表达情况的相关性 结肠癌接头蛋白Gab2的阳性表达与病人的性别、年龄等临床指标无相关性，而与结肠癌的是否发生远处转移、肿瘤直径大小等密切相关（P＜0.05），见表1。

表1 结肠癌病人的临床病理参数指标与接头蛋白的表达情况的相关性［n（%）］

2.2 接头蛋白Gab2阳性组与阴性组的MMP-9、MMP-2指标水平的评估比较 接头蛋白Gab2阳性组的MMP-9、MMP-2指标水平显著高于Gab2阴性组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 接头蛋白Gab2阳性组与阴性组的MMP-9、MMP-2指标水平的评估比较（ng/mL）

3 讨论

结肠癌是发病率占胃肠道肿瘤的第3位的消化道恶性肿瘤，以40～50岁年龄好发，病灶多见于直肠与乙状结肠交界处，男女之比为2～3∶1［4-5］。结肠癌可沿肠壁环行发展，向周围组织浸润时经淋巴管、血流转移和局部侵犯，并沿肠管纵径上下蔓延或延伸至肠壁深层，同时可向腹腔内种植［6-7］。Gab2作为支架蛋白，在人体内广泛表达，其在多种受体，如血管内皮生长因子受体、上皮细胞生长因子受体等下游的信号通讯网路中发挥着重要作用。Gab2可由酪氨酸激酶磷酸化激活，招募信号转运分子（富含SH2结构域），接受胞外多种因子刺激，活化下游PI3K/AKT、SHP2/Ras/ERK等一系列信号转导途径，在细胞增殖、分化、凋亡等生理过程中发挥重要作用。研究显示，Gab2与乳腺肿瘤的恶性程度有密切联系，二者呈正相关性。同时，Gab2在黑色素痣和原发性黑素瘤中低表达，而在转移性黑素瘤中过表达。诸多研究显示，Gab2在肺结肠癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中过表达，提示，Gab2可能是一个潜在的肿瘤标志物。MMPs是一类与锌结合的酶家族，具有讲解ECM活性，参与肿瘤细胞浸润和转移。MMP-2 和MMP-9是其中重要一部分，前者不能讲解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ间质纤维胶原，但可降解明胶Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原，后者是MMPs酶家族中分子量最大的，能对靠近中表面的ECM、BM进行降解、破坏，使肿瘤细胞沿着被破坏的BM进一步向周围组织浸润，加速疾病的进展，还可通过新生血管生成来促进肿瘤生长和扩散。MMP-9与MMP-2相比，前者作用更广泛，但二者的作用几乎相同，其能降解明胶与Ⅳ、Ⅴ、Ⅺ型胶原、层粘连蛋白、弹性蛋白，也能降解Ⅰ、Ⅲ基质蛋白和间质胶原。研究发现，MMP-2与MMP-9与肿瘤的浸润、转移关系密切，在多种恶性肿瘤，如胃癌、结肠癌等的发生发展中发挥着重要作用。目前，对于Gab2对结肠癌细胞MMP合成的影响已成为医学学者的重要研究内容［8］。

本研究探析接头蛋白Gab2对结肠癌细胞MMP合成的影响，结果显示：结肠癌接头蛋白Gab2的阳性表达与病人的性别、年龄等临床指标无相关性，而与结肠癌的是否发生远处转移、肿瘤直径大小等临床指标密切相关，差异有统计学意义；接头蛋白Gab2阳性组的MMP-9、MMP-2指标水平显著高于Gab2阴性组，与刘岩青等［9］的研究结果大体一致，Gab2在SHP02激活突变导致的结肠癌肿瘤细胞异常增殖活化及其导致器官损伤中发挥促进作用［10-11］，可上调合成MPP水平，SHP-2激活突变后磷酸酶活性增高，与Gab2结合增多，进而活化下游相关信号通路［12］。

综上所述，接头蛋白Gab2可通过影响结肠癌细胞MMP-9、MMP-2的表达进而影响结肠癌细胞的转移侵袭。

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［7］ 邓艳, 柯晴. 结肠癌与直肠癌在癌变分子机制及信号通路方面的对比［J］. 中国医学创新, 2016, 18(05): 77-79, 80.

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Effect of Gab2on MMP synthesis of colon cancer cells

Liu Yu-hui, Sun Qing-qing, Guo Fang, Liu Jun-ling
(Department of Oncology, General Hospital of Shenyang Military Area Command, Shenyang 110006, China)

Objective To investigate the effect of Gab2on the MMP synthesis of colon cancer cells. Methods Clinic in July 2015～2016 in April in our hospital accepted surgery for colon cancer patients with clinical pathology and tissue specimens, by Western blot was used to detect the joint GAB2 protein level of adaptor protein GAB2 on colon cancer cell invasion related protein of MMP-2 and MMP-9 synthesis influence. Results Cancer joint GAB2 protein positive expression with the patient’s gender, age and other clinical indicators no correlation, and is closely related to the colon cancer occurrence of distant metastasis, tumor size and clinical indicators, the difference is statistically significant; joint GAB2 protein positive group of MMP-9, MMP-2 level was significantly higher than that of the GAB2 negative group, the difference is statistically significant. Conclusion The adaptor protein Gab2 can affect the metastasis and invasion of colon cancer cells by affecting the expression of MMP-9 and MMP-2 in colon cancer cells.

MMP-2; cell invasion and metastasis; colon cancer cells; Gab2

R735.35

A

1673-016X（2017）02-0143-03

2017-01-02

刘玉辉，E-mail:lyuf113@163.com