MP感染对哮喘患儿BALF中T细胞功能及细胞因子水平的影响分析

叶武成，叶 鹏，贺 波

（1.陕西省榆林市第四人民医院，榆林719000；2.延安大学医学院，延安716000；3.榆林市儿童医院，榆林719000）

MP感染对哮喘患儿BALF中T细胞功能及细胞因子水平的影响分析

叶武成1，叶 鹏2，贺 波3

（1.陕西省榆林市第四人民医院，榆林719000；2.延安大学医学院，延安716000；3.榆林市儿童医院，榆林719000）

目的：探讨肺炎支原体（MP）感染对哮喘患儿支气管灌洗液（BALF）中T细胞功能、细胞因子水平的影响作用。方法：选取本院儿科2013年4月～2015年9月收治81例哮喘患儿作为研究对象，其中合并MP感染的哮喘患儿39例（MP组）、42例哮喘患儿MP感染阴性（非MP组），30例因上呼吸道感染的非哮喘、非MP感染患儿作为对照组，采用流式细胞仪检测三组BALF中国T细胞亚群、细胞因子水平。结果：MP组和非MP组患儿的FEV1%测定值显著的低于对照组；三组患儿BALF中T细胞、细胞因子检测结果，MP组患儿的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、INF-γ值均显著的低于非MP组和对照组，CD8+、IL-4、IL-5、IL-4/INF-γ显著的高于非MP组和对照组；非MP组患儿的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、INF-γ值均显著的低于对照组，CD8+、IL-4、IL-5、IL-4/INF-γ显著的高于对照组。结论：MP感染会进一步降低哮喘患儿的T细胞功能、炎症因子水平增高，这可能导致哮喘患儿病情加重有关。

肺炎支原体；哮喘；支气管灌洗液；T细胞；细胞因子

支气管哮喘简称哮喘，是儿科常见的呼吸系统疾病，以可逆性气流受限为主要病变特征，临床表现为咳嗽、咳痰、气喘等症状，活动时加剧，严重影响患儿的生存质量。在受寒、吸入过敏原、呼吸道感染等诱因的作用下易急性发作。肺炎支原体（MP）感染是常见的哮喘发作因素，已引起临床的高度重视［1］。

近年来随着内镜技术的不断发展，纤维支气管镜在呼吸系统疾病的诊断和治疗中发挥了越来越重要的作用。支气管灌洗液（BALF）可获取深部分泌物，为确定引起感染的致病微生物种类、指导临床用药提供便利。有研究发现，哮喘患儿气道、肺实质均存在慢性炎症反应，目前对于患儿血清细胞因子、T细胞亚群的研究报道较多，而对于支气管深部分泌物中细胞因子、T细胞亚群的研究报道较少见［2］。本研究采用支气管镜进行灌洗，探讨了MP感染对哮喘患儿BALF中T细胞功能、细胞因子水平的影响作用。

1 资料与方法

1.1 纳入排除标准

1.1.1 纳入标准 （1）纳入患儿的诊断标准参考《儿科学》第七版中的标准；（2）MP感染的诊断实验室标准：双份血清（间隔1-2周）MP-IgM抗体恢复期滴度上升4倍或下降至原来的1/4，单份血清抗体滴度升高＞1：160；（3）三组患儿因临床确诊需要进行了纤支镜检查并且留有BALF样本；（4）患儿的各项基础资料、检查资料完整。

1.1.2 排除标准 （1）营养不良的患儿；（2）合并先心病、呼吸道畸形或发育不良的患儿；（3）间质性肺炎、呼吸衰竭、肺结核患儿；（4）支气管异物、近期应用糖皮质激素治疗的患儿；（5）各项临床资料不完整的患儿。

1.2 研究对象 选取本院儿科2013年4月～2015年9月收治81例哮喘患儿作为研究对象，其中合并MP感染的哮喘患儿39例（MP组）、42例哮喘患儿MP感染阴性（非MP组），30例因上呼吸道感染的非哮喘、非MP感染患儿作为对照组。

MP组39例，其中男22例、女性17例，年龄3～12岁，平均6.1±2.4岁，病程9.4±5.3d。非MP组42例，其中男24例、女性18例，年龄3～12岁，平均6.5± 2.6岁，病程10.9±6.1d。对照组30例，其中男17例、女性13例，年龄3～12岁，平均5.9±1.9岁，病程10.0 ±5.9d。三组患儿的一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.3 纤维支气管镜检查 术前患儿家长签署支气管镜检查知情同意书。选用日本Olympus公司3C40型纤维支气管镜进行右肺中叶灌洗，支气管镜直径为3.6mm，灌洗液为37℃灭菌生理盐水。术前30 min肌肉注射阿托品0.02mg/kg，静脉推注咪达唑仑 0.2mg/kg。取仰卧位，将纤维支气管镜经鼻腔导入气管，通过声门进入气管隆突后，经活检孔喷洒2%利多卡因1ml，再采用5 ml空气加压注入进行局部表面麻醉。灌洗液剂量为1ml/kg，共3次，回收灌洗液。采用2层无菌纱布过滤后，置于 4℃、4000 r/min离心，取上清液，保存于-80℃冰箱待检。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 观察指标 检测并比较三组患儿的BALF中T细胞亚群：CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+；检测并比较三组患儿BALF中细胞因子：白细胞介素-4 （IL-4）、γ-干扰素（INF-γ）、白细胞介素-5（IL-5）；检测并比较三组患儿的肺功能指标（FEV1%）。

1.4.2 检测方法 BALF中T 细胞亚群测定采用美国Becton Dickinson 公司流式细胞仪、CellQuest软件检测，按说明书操作。在CellQuest软件中读出CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+。

BALF中IL-4、INF-γ、IL-5均采用双抗体夹心免疫（ELISA）法测定，试剂盒购自北京晶美生物工程有限公司，严格按照操作说明进行。在美国PE公司酶标仪450nm 处测OD值。以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。在标准曲线上代入样品OD值可计算出相应浓度。

肺功能指标采用日本MINATO公司肺功能仪检测，嘱患儿最大吸气后尽可能呼出最大气量，由设备直接读数。

1.5 统计学方法 正态分布的计量指标采用均数±标准差进行描述，三组间比较采用方差分析、组间两两比较采用LSD-t检验；P值＜0.05表示差异具有统计学意义；统计软件采用SAS9.1。

2 结果

2.1 三组患儿的肺功能检测 MP组和非MP组患儿的FEV1%测定值显著的低于对照组（P＜0.05）；结果见表1。

表1 三组患儿的肺功能检测

2.2 三组患儿的BALF中T细胞亚群测定值比较 表2显示，三组患儿BALF中T细胞检测结果，MP组患儿的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+值均显著的低于非MP组和对照组（P＜0.05），CD8+显著的高于非MP组和对照组（P＜0.05）；非MP组患儿的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+值均显著的低于对照组（P＜0.05），CD8+显著的高于对照组（P＜0.05）。

表2 三组患儿的BALF中T细胞亚群测定值比较

2.3 三组患儿的BALF中细胞因子水平比较 三组患儿BALF中细胞因子检测结果，MP组患儿的IL-4、IL-5、IL-4/INF-γ值均显著的高于非MP组和对照组（P＜0.05），INF-γ显著的低于非MP组和对照组（P＜0.05）；非MP组患儿的IL-4、IL-5、IL-4/INF-γ值值均显著的高于对照组（P＜0.05），INF-γ显著的高于对照组（P＜0.05）；结果见表3。

表3 三组患儿的BALF中细胞因子水平比较

3 讨论

MP是一种介于细菌和病毒之间的致病微生物，也是引起儿童呼吸道感染的重要病原微生物之一［3］。MP不仅可直接引起宿主气道黏膜损伤，还可作为过敏原诱发IgE介导的Ⅰ型变态反应，尤其对于哮喘患儿可产生严重不利影响，诱发哮喘的急性发作［4］。此外MP感染还可引起肺外多系统损害，甚至引起患儿死亡。存在哮喘病史的患儿在发生MP感染后机体发生Ⅰ型变态反应，诱发哮喘的急性发作。反复发作后患儿的肺功能下降，不利于患儿的生长发育［5］。本研究中MP组和非MP组患儿的FEV1%测定值显著的低于对照组，这一结果提示，哮喘患儿的肺功能比非哮喘的其他呼吸系统疾病患儿差。

哮喘是一种气道慢性炎症性疾病，由多种炎症细胞和炎症因子共同参与，属于变态反应性疾病［6］。哮喘患儿机体存在着体液免疫和细胞免疫功能的双重紊乱，辅助性 T 细胞功能增强，抑制性T细胞功能低下，Th1/Th2比例失衡［7］。CD3+是总T淋巴细胞，反映机体细胞免疫功能状态［8］。CD4+是诱导型T细胞，可调节细胞免疫功能，促进B细胞、T细胞、其他免疫细胞的增殖、分化，故又称为辅助性T淋巴细胞［9］。CD8+是细胞毒抑制型T细胞，其生理功能与CD4+功能相反［10］。CD4+/CD8+细胞比例常用来评价机体的免疫功能状态。

本研究中三组患儿BALF中T细胞、细胞因子检测结果发现，非MP组患儿的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+值均显著的低于对照组，CD8+显著的高于对照组。MP组患儿的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+值均显著的低于非MP组和对照组，CD8+显著的高于非MP组和对照组。这一结果提示，哮喘可引起机体细胞免疫功能异常，其中由MP感染导致的哮喘患儿机体细胞免疫功能更加紊乱，CD4+/CD8+的下降程度在MP感染的哮喘患儿中尤为突出，提示MP感染的哮喘患儿气道局部免疫防御能力下降。

MP感染后患儿机体一方面产生大量的TNF-α等促炎因子以清除病原微生物，促进损伤的黏膜组织修复，另一方面又通过抑炎因子的表达抑制促炎因子，减少对机体的损伤。哮喘患儿机体内环境的稳定需要依靠促炎因子与抑炎因子之间的平衡而维持［11］。CD8+细胞可分泌IFN-γ、TNF-α等炎症细胞因子，溶解宿主细胞膜，是哮喘发病过程的重要启动因子。反复呼吸道感染可使 CD8+细胞在呼吸道过度聚集而引起呼吸道损伤，引起气道异常浸润和免疫损伤，进一步引起免疫功能下降。

INF-γ是哮喘发作的重要启动因子，通过作用于呼吸道血管内皮细胞，增加黏附因子的表达［12］。IL-5是由Th2 细胞、肥大细胞分泌的炎性细胞因子，可促进炎性细胞增殖和分化，在免疫炎症反应中发挥重要的作用。IL-5可促使EOS前体释放，增强 EOS的趋化、活化、募集，导致气道高反应性，加重炎症反应，从而诱发哮喘发作。IL-5与IL-4还可发挥协同作用，刺激B细胞产生大量的IgE，进而引发速发型哮喘变态反应。本研究中非MP组患儿的INF-γ值均显著的低于对照组，IL-4、IL-5、IL-4/INF-γ显著的高于对照组。而MP组患儿的INF-γ值均显著的低于非MP组和对照组，IL-4、IL-5、IL-4/INF-γ显著的高于非MP组和对照组。这一结果提示，哮喘急性发作可引起患儿机体免疫炎性损伤，其中由MP感染导致的哮喘患儿机体炎性损伤程度更加严重。

本研究结果表明：MP感染会进一步降低哮喘患儿的T细胞功能、炎症因子水平增高，这可能导致哮喘患儿病情加重有关。

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Analysis of the effect of MP infection on T cell function and cytokine levels in BALF of children with asthma

Ye Wu-cheng1, Ye Peng2, He Bo3
(1. Yulin Fourth People’s Hospital, Yulin 719000, China; 2. Medical College of Yan’an University, Yan’an 716000, China; 3. Yulin Children’s Hospital, Yulin 719000, China)

Objective To investigate the effect of Mycoplasma pneumoniae (MP) infection on T cell function and cytokine levels in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of asthmatic children. Methods Selected the pediatric hospital in April 2013 ～September 2015 were treated 81 cases of asthmatic children as research subjects, including children with asthma with MP infection in 39 cases (MP group), MP 42 cases of infection in children with asthma negative (non-MP group), 30 cases of upper respiratory tract infections due to non-asthmatic, non-MP infection in children as a control group, using flow cytometry three BALF Chinese T cell subsets, cytokine levels. Results FEV1% measured value MP group of children and non-MP group was significantly lower than the control group; cell, cytokine detection results, CD3 children MP group T three children BALF +, CD4 +, CD4 + / CD8 +, INF-γ were significantly lower than non-MP group and the control group, CD8 +, IL-4, IL-5, IL-4 was significantly higher than that INF-γ non-MP group and control group; CD3 +, CD4 +, CD4 + / CD8 +, INF-γ value in children with non-MP group were significantly lower than the control group, CD8 +, IL-4, IL-5, IL-4 / was significantly higher than that of INF-γ . Conclusion MP will further reduce the infection of T-cell function in children with asthma, increased levels of inflammatory factors, which may cause asthma exacerbations in children related.

mycoplasma pneumoniae; asthma; bronchoalveolar lavage fluid; T cell; cytokine

R725.6

A

1673-016X（2017）02-0125-04

2016-12-12

叶武成，E-mail:1691637656@qq.com