AIP1在肝细胞癌中的表达及其与EMT的相关性研究

孙 波，常睿敏

（中南大学湘雅医院，长沙 410008）

AIP1在肝细胞癌中的表达及其与EMT的相关性研究

孙 波，常睿敏

（中南大学湘雅医院，长沙 410008）

目的：研究肌动蛋白相互作用蛋白1（AIP1）在人肝细胞癌（HCC）中的表达情况，并探究其表达与上皮间质转化（EMT）的相关性。方法：选取6个肝癌细胞系和正常的肝细胞系L02，以及40对HCC组织和配对的癌旁非瘤肝组织标本，通过qRT-PCR检测AIP1 mRNA的表达，western blot检测AIP1蛋白的表达，最后采用免疫组织化学染色（IHC）验证组织中AIP1的表达并分析其表达与EMT标志物的关系。结果：肝癌细胞系中AIP1的mRNA和蛋白表达水平都显著高于正常肝细胞系L02。同样在新鲜冰冻的组织标本中，肝癌组织中AIP1的mRNA和蛋白表达都显著高于相应的癌旁非瘤肝组织，且通过IHC得到了进一步的证实。最后，IHC结果发现AIP1的上调可能与肝癌的EMT现象相关。结论：AIP1在肝癌中的表达发生上调，并可能通过促进肝癌的EMT而促进肝癌的侵袭转移。

肝细胞癌；肌动蛋白相互作用蛋白1；上皮间质转化

原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球男性中第五位最为常见的恶性肿瘤，也是第二大引起癌症死亡的原因，而中国占了肝癌新发和死亡病例中的一半以上。［1］尽管近年来肝癌的治疗技术取得了飞速的进步，但肝癌的预后仍不让人满意，肝癌切除术后的5年生存率仅30%左右，导致肝癌不良预后的主要原因仍是复发和转移。［2］肝癌的转移是一个复杂的级联反应过程，涉及许多重要的生物学过程的改变，其中就包括上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。［3］肌动蛋白相互作用蛋白1（actininteracting protein 1，AIP1）能调控上皮细胞间黏着连接和紧密连接的结构和重塑，［4］并能调节细胞骨架而影响细胞的形态［5］，这些现象都与EMT的特征显著相关。然而，AIP1在肝癌中表达情况及其与肝癌EMT的关系仍未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 40例临床标本取自2015年间湘雅医院外科行肝癌切除术后的肝癌组织及其配对的癌旁非瘤肝组织（距肿瘤边缘≥2cm），每个标本都分别用液氮速冻后置于零下80℃和福尔马林溶液进行保存。

1.1.2 试剂 兔抗AIP1单克隆抗体（ab173574，Abcam公司）；鼠抗β-actin单克隆抗体（60008-1-Ig，Proteintech公司）；兔抗E-cadherin抗体（#3195，CST公司），兔抗Vimentin抗体（#5741，CST公司），HRP标记的抗鼠和抗兔的二抗（ZB-2301，ZB-2305，北京中杉金桥生物技术公司）；二步法免疫组化检测系统（PV-9000，北京中杉金桥生物技术公司）；Trizol提取液（Invitrogen，Carlsbad，USA）；逆转录试剂盒（Takara，中国大连）；SYBR® Fast qPCR Mix kit（Takara，中国大连）；RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白定量试剂盒、ECL发光液均购自南京凯基生物科技发展有限公司。qRT-PCR引物是由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 所有细胞系都是置于37℃，含5% CO2的细胞培养箱（Thermo Forma，Marietta，Ohio）中进行培养。细胞的复苏、传代和冻存等步骤均是按照培养细胞所需的标准流程进行。

1.2.2 qRT-PCR检测AIP1 mRNA表达水平 分别取新鲜肝癌及其配对的癌旁非瘤组织（-80℃冰箱保存）约50～100 mg，在液氮中充分研磨后用Trizol法提取出总RNA，并用紫外分光光度仪检测OD260和OD280的值来鉴定所提取的RNA质量和浓度。接着按照逆转录试剂盒的实验步骤将总RNA逆转录成cDNA。最后根据Takara qRT-PCR试剂盒的说明进行qRT-PCR实验。简而言之，取2μl的cDNA模板建立20μl反应体系，反应条件为：95℃预变性30 秒，接着PCR反应为95℃下5 秒、60℃下15 秒，共40个循环。AIP1 基因扩增的上游引物为：5’- AGAAGGACCACCTGCTCAGTGT-3’；下游引物为：5’- ATGCACCGTCAGACACTGGATC-3’；转录物长度为125bp。内参基因GAPDH的上游引物为：5’-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3’；下游引物为：5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3’；转录物长度为131bp。细胞系总RNA的提取直接采用Trizol法，其余步骤与上述一致。

1.2.3 Western blot检测AIP1蛋白表达水平 取保存于-80℃的新鲜冰冻组织约50mg，在液氮中匀浆研磨后，用含1% PMSF的RIPA裂解液提取总蛋白。细胞系的蛋白直接用含1% PMSF的RIPA裂解液用细胞刮勺提取。通过BCA蛋白定量法测定样本蛋白浓度后，采用SDS-PAGE 电泳法和蛋白质免疫印迹检测AIP1蛋白表达情况。配制10%浓度的分离胶，蛋白上样量都为10μL，80V电压预跑30min后再120V 60min。采用湿转法将胶中蛋白分离到PVDF膜，转膜为恒流200mA 下3小时。接着将膜在5%脱脂牛奶中封闭30min后，用AIP1和β-actin一抗1：1000的浓度4℃孵育过夜。次日，采用相应的二抗孵育30min后，采用化学发光法和暗室胶片曝光法采集蛋白表达情况。

1.2.4 免疫组织化学染色和评估 福尔马林固定的组织标本通过脱水、石蜡包埋后，切成4μm厚的组织切片。IHC实验采用链霉亲和素-过氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）系统检测组织切片中的AIP1蛋白表达情况。切片通过烤片、脱蜡、水化、微波抗原修复后，用3% H2O2室温孵育30 min以灭活内源性过氧化物酶，然后用羊血清封闭液室温下孵育30 min以进行抗原封闭，接着每张切片上滴加60μl一抗工作液（AIP1，1：200；E-cadherin，1：100；Vimentin，1：400）4℃孵育过夜。次日，切片复温后按照IHC试剂盒要求依次滴加聚合物辅助剂和二抗，DAB显色液镜下控色（控色时间保证一致）后苏木素染核20秒。最后脱水、透明、封片后镜下检阅。免疫组化评分是根据半定量的方法，即根据免疫组化染色强度和阳性细胞百分比计算［6］。

1.3 统计方法

使用统计软件SPSS 19.0 和Graphpad prism 6对相应数据进行分析。计量资料以平均值±标准差表示，并采用t检验进行比较，P＜ 0.05 定义为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AIP1在肝癌细胞系和正常肝细胞系中的表达情况 通过qRT-PCR实验发现，肝癌细胞系中的AIP1 mRNA表达水平显著高于L02细胞系，并且侵袭转移能力较强的Hep3B、MHCC97-H和HCCLM3细胞系的表达水平高于侵袭转移能力较弱的PLC/PRF5，SMMC7721 和HepG2细胞系（图1 A）。同样，western blot检测AIP1蛋白表达水平也得到一致的结果，肝癌细胞系中AIP1蛋白表达水平显著高于L02细胞，以恶性程度最高的HCCLM3细胞系表达最高。（图1 B）

图1 （A）qRT-PCR检测肝癌细胞系和正常肝细胞系L02中AIP1 mRNA表达水平。（B）Western blot检测肝癌细胞系和正常肝细胞系L02 中AIP1蛋白表达水平。HCC细胞系 vs. L02：全部P＜0.01。

2.2 AIP1在肝癌和癌旁非瘤肝组织中的表达情况

qRT-PCR检测40对肝癌和癌旁非瘤肝组织中AIP1 mRNA表达水平显示，与癌旁非瘤肝组织相比，肝癌组织中AIP1 mRNA表达水平显著上调。（图2 A）同样western blot实验进一步发现肝癌中AIP1蛋白表达水平显著高于相应的癌旁非瘤肝组织。（图2 B）

图2 （A）qRT-PCR检测肝癌和癌旁非瘤肝组织中AIP1 mRNA表达水平。（B）Western blot检测肝癌和癌旁非瘤肝组织中AIP1蛋白表达水平。HCC组织 vs. ANLT：P＜0.01。ANLT：癌旁非瘤肝组织；T：肝癌组织。

2.3 IHC检测AIP1及EMT标志物的表达情况 通过IHC实验进一步发现，肝癌组织中AIP1的蛋白表达水平显著高于癌旁非瘤肝组织。（图3 A）E-cadherin和Vimentin是检测EMT发生的常用标志物，发生EMT时前者的表达通常降低而后者表达常升高［7］。通过对肝癌组织的连续切片进行IHC检测发现，AIP1高表达的肝癌组织通常低表达E-cadherin和高表达Vimentin，而AIP1相对低表达的肝癌组织常伴有E-cadherin的高表达和Vimentin的低表达。（图3 B）这些结果证实，肝癌中AIP1的表达上调可能与肝癌的EMT相关。

图3 （A）IHC检测肝癌和癌旁非瘤肝组织中AIP1表达情况，40例病例AIP1各个表达水平所占百分比统计于右侧柱状图。（B）典型的肝癌组织连续切片通过IHC检测AIP1、E-cadherin和Vimentin的表达情况。ANLT：癌旁非瘤肝组织；T：肝癌组织。

3 讨论

肿瘤转移是目前临床上肿瘤治疗的一大挑战。由于转移的肿瘤很难进行手术切除或更容易对传统的放化疗形成耐受，肿瘤相关的死亡90%以上都是由转移造成的。肿瘤转移是一个动态变化的过程，原发肿瘤中的部分肿瘤细胞获得高度侵袭的能力而向远处播散，并能在其他的组织微环境中存活，最终在远处部位定植生长［8］。上皮和上皮源性肿瘤的细胞之间通常通过一些特异性的连接结构紧密的连接在一起，这些结构包括黏着连接、桥粒连接、紧密连接和缝隙连接［9］。此外，上皮细胞还与下方的基底膜结构相互作用而形成特殊的极性结构，这对维持正常的上皮功能都是必不可少的［10］。然而，肿瘤细胞在发生EMT转变时，细胞间的连接首先会发生分解，表现为上皮标志物E-cadherin的表达丢失，而间质标志物Vimentin的表达升高。然后，肿瘤细胞由原来的基底-顶端排列极性转变为前-后极性。接着，皮层肌动蛋白和肌动蛋白张力纤维的改变导致细胞骨架发生重塑。最后，蛋白溶解酶的激活，比如基质金属蛋白酶，会导致细胞-基质间的粘附发生改变，从而促进肿瘤的侵袭［11］。因此，肿瘤在发生发展过程中会启动某些基因的表达或激活某些相关的信号通路，进而调节肿瘤细胞本身的形态，或改变细胞与细胞间的连接状态，最后促进肿瘤的侵袭转移。

AIP1可能就是属于这类基因中的一员。我们的研究发现，肝癌细胞系与肝癌组织中AIP1 mRNA 的表达水平较正常肝细胞及相应的癌旁非瘤肝组织显著上调，而通过western blot实验也进一步证实AIP1蛋白在肝癌细胞系及肝癌组织中的表达亦显著高于正常肝细胞系及相应的癌旁非瘤肝组织。更为重要的是，AIP1的表达与肝癌的侵袭转移能力密切相关，表现在高侵袭能力的HCCLM3细胞系中AIP1的表达最高，而侵袭转移能力相对较弱的HepG2细胞AIP1表达也相对较低。最近的研究发现AIP1在原发性胶质母细胞瘤中表达升高，并且AIP1高表达与患者的不良预后显著相关，单多因素分析发现AIP1高表达是影响胶质母细胞瘤患者预后的独立危险因素［12］。此外，在乳腺癌中，特别是肿瘤细胞的侵袭前缘，AIP1的表达发生显著上调，并且AIP1的上调能促进乳腺癌细胞的迁移，并与患者的不良预后显著相关［13，14］。但是到目前为止，AIP1是如何调控肿瘤细胞的侵袭转移仍不是十分明了。已有研究发现AIP1能促进丝切蛋白介导的肌动蛋白纤维解聚。［15］肌动蛋白纤维聚合和解聚在细胞的迁移运动中有重要作用，加之AIP1也能调节细胞的间连接状态和细胞骨架，我们推断AIP1可能与肿瘤的EMT相关。我们通过IHC连续切片发现，AIP1高表达的肝癌组织同时低表达E-cadherin和高表达Vimentin，而相对低表达AIP1的肝癌组织常伴有E-cadherin的高表达和Vimentin的低表达。因此AIP1高表达可能通过促进EMT过程而促进肝癌的侵袭转移。尽管如此，AIP1高表达与肝癌患者的预后关系如何？AIP1调控肝癌侵袭转移或EMT过程的具体分子机制是什么？这些问题还需要得到进一步的探究。这将不仅有助于判断肝癌患者术后的预后情况，更有助于研发出新型的抑制肝癌侵袭转移的靶向药物。

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The study on AIP1 expression in hepatocellular carcinoma and its association with EMT process

Sun Bo, Chang Rui-min
(Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China)

Objective To study the expression of actin-interacting protein 1(AIP1) in human hepatocellular carcinoma (HCC) and further investigate the association of its expression with epithelial mesenchymal transition (EMT). Methods We adopted qRT-PCR and western blot to respectively detect AIP1 mRNA and protein expression of six selected HCC cell lines and one normal liver cell line L02, and 40 pairs of HCC tissues and corresponding adjacent normal liver tissues. Immunohistochemistry (IHC) was further used to confirm the results and analyze the association of AIP1 expression with EMT process. Results The mRNA and protein expression of AIP1 in HCC cell lines and fresh frozen HCC tissues were significantly higher than L02 cell line and corresponding adjacent normal liver tissues respectively. IHC analysis confirmed the results and found AIP1 upregulation in HCC associate with EMT process. Conclusion The expression of AIP1 in HCC is up-regulated and may promote HCC invasion and metastasis by facilitating EMT process.

hepatocellular carcinoma; actin-interacting protein 1; epithelial mesenchymal transition

R735.7

A

1673-016X（2017）02-0035-04

2017-01-02

常睿敏，E-mail:changruimin@163.com