氟他胺致小鼠阴茎组织中sHsps表达改变的研究

唐家泷，贺明，何梦如，刘浩，李金琦，曾天信，朱勇飞，柳 强

（湖南师范大学医学院预防医学系，长沙410013）

氟他胺致小鼠阴茎组织中sHsps表达改变的研究

唐家泷，贺明，何梦如，刘浩，李金琦，曾天信，朱勇飞，柳 强

（湖南师范大学医学院预防医学系，长沙410013）

目的：研究氟他胺致小分子热休克蛋白基因（sHsps）在小鼠阴茎组织中的表达改变。方法：ICR小鼠受孕后，将其随机分为实验、对照两组，实验组和对照组各16只，于孕12d（GD12）-GD19，每天经口给予实验组孕鼠混悬于玉米油中的氟他胺80 mg/kg/day，对照组孕鼠给予等体积的玉米油。分别于出生后第7、21天（PND7、PND21）在对照组、实验组随机取8窝子鼠，并在对照组随机选取雄性小鼠1只，实验组选取肛门与生殖器之间的距离（AGD）正常和异常雄性小鼠各1只。取上述雄性子鼠的阴茎，利用实时荧光定量PCR相对定量检测阴茎组织中sHsps的表达丰度。结果：无论是实验组还是对照组，sHsps在PND7、PND21的小鼠阴茎组织中都有表达。除Hspb9在PND7实验组AGD“正常”雄性子鼠阴茎中的表达和对照组无差异外，Hsp27、Hspb3、Hspb5、Hsp20、Hspb9在实验组PND7、PND21中的表达均高于对照组。实验组Hsp25、Hspb2、Hspb4、Hspb10、HO-1在PND7、PND21的表达均低于对照组。实验组Hsp22在PND7的表达和对照组无差异，但在PND21的表达则高于对照组。Hspb7在PND7实验组中的表达高于对照组，而在PND21实验组中的表达则低于对照组。结论：Hsp25、Hspb2、Hspb4、Hspb10、HO-1可能和小鼠阴茎异常发生有关，Hspb7可能是小鼠阴茎发育中起重要作用的基因，而Hsp27、Hspb3、Hspb5、Hsp20、Hspb9和Hsp22在小鼠阴茎发育时可能起应激保护作用。

小分子热休克蛋白；氟他胺；阴茎

雄性后代在子宫内暴露于抗雄激素往往导致雄激素依赖性发育标记物（例如肛门与生殖器之间的距离（anogenitaldistance，AGD）等的改变，并连同明确的器官异常发生（如生殖器官畸形和生殖道病变）［1］。热休克蛋白（heat shockprotein，Hsps）被认为是细胞与生物体形态发育的伴侣，且与胚胎的正常生长发育和畸形的发生都有密切的关系［2］。小分子Hsps（small heat shock proteins，sHsps）是Hsps中的一个家族，我们以前的研究发现其和腭裂、短肢畸形发生有关［3，4］。本研究拟检测非甾体类抗雄激素药物氟他胺致小鼠阴茎组织中sHsps家族的表达，以期发现其在小鼠阴茎发育中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂 高速冷冻离心机（HERMLE ZK400，德国EPENDORF公司），BioSpecmini型核酸/蛋白分析仪（日本岛津公司），7500型荧光定量PCR仪（美国Life Technology公司），莱卡倒置显微镜（DMI3000B，德国莱卡公司）。

氟他胺（美国Sigma公司），Trizol总RNA提取试剂盒（美国Invitrogen公司），逆转录试剂盒（美国Promega公司），SYBR kit（美国Life Technology公司），sHsps和内参照β-actin的荧光定量PCR引物均由赛默飞世尔科技中国（上海）合成（引物序列见表1），其余试剂均为国产分析纯。

表1 sHsps及β-actin的QRT-PCR引物序列

1.2 实验动物及样品收集 ICR小鼠（湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2013-0004），8～10周龄，雌鼠体重25～30 g，雄鼠体重30～35 g。饲养间室温20～25 ℃，相对湿度40%～60%，循环光照为12/12 h。适应性饲养1 周后，雌、雄按2∶1的比例合笼交配，查到阴栓之日为孕期（gestational day，GD）第0 d（GD0），并将孕鼠随机分为实验、对照两组，实验组和对照组各16只。在GD12-GD19，实验组孕鼠给予混悬于玉米油中的氟他胺80 mg/kg/day，对照组孕鼠给予等体积的玉米油。分别于子鼠出生后第7和21 d（postnatal day7、21，PND7、PND21）（出生当天记为第0 d，即PND0）在两组均随机取8窝，每个时间点对照组均每窝随机取1 只雄性子鼠，将其颈椎脱臼处死、并取其阴茎置于液氮中保存；而实验组每窝则随机选取1只肛门到生殖结节之间的距离（anogenital distance，AGD）明显比对照组短［1］（用游标卡尺测量AGD，数据见结果2.1）的雄性子鼠和1 只“正常”的雄性小鼠，将其颈椎脱臼处死、并取其阴茎置于液氮中。

1.3 总RNA提取、实时荧光定量PCR及其数据处理

将收集的样品用Trizol裂解，按试剂盒的说明提取总RNA，RNA溶于无核酸酶水中。取约1 μg总RNA进行逆转录，合成cDNA，反应体系和反应条件均参照试剂盒的说明。

将所得cDNA进行PCR扩增反应，反应体系如下：SYBR buffer 6.5μl，cDNA 1.0μL，上下游引物各0.75μL，Mili Q水16.0μL。反应条件为：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min（40个循环）。

通过各目标基因的PCR扩增曲线Ct值与所设内参照基因（β-actin）的Ct值相比较（即ΔCt值）来对各基因的原始拷贝数进行相对定量分析：ΔCt=目标基因Ct－内参照基因Ct，通过内均一化处理之后，目标基因相对于内参照基因的量为Y= 2-ΔCt［5］。

1.4 统计分析 运用统计分析软件SPSS17.0，采用χ2检验、方差分析法统计分析所有结果，差异显著性标准为α=0.05。

2 结果

2.1 实验组和对照组雄性子鼠AGD 用药期间母鼠无死亡，母鼠体重无减轻。PND7对照组和实验组雄性仔鼠分别为38只和43只（均为8窝），本研究以AGD的长度来判定雄性子鼠的正常和异常情况［1］，发现实验组AGD异常雄性子鼠为24只（55.8%），AGD为4.06±0.09 mm，明显短于对照组正常雄性子鼠。PND21对照组和实验组雄性子鼠均为41只，实验组AGD异常雄性子鼠为22只（53.7），AGD为11.83±0.31 mm，明显短于对照组正常雄性子鼠。

表2 对照组和实验组AGD正常及异常雄性子鼠数（只）

2.2 实验组和对照组sHsps表达丰度的比较

表3 实验组和对照组雄性子鼠阴茎中sHsps表达丰度（n=8）

由表3可见，无论是实验组还是对照组，sHsps在PND7、PND21的小鼠阴茎组织中都有表达；PND7的Hspb4在实验组和对照组均为低表达。除Hspb9在PND7实验组AGD“正常”雄性子鼠阴茎中的表达和对照组无差异外，Hsp27、Hspb3、Hspb5、Hsp20、Hspb9在PND7、PND21实验组所有雄性子鼠阴茎中的表达均高于对照组。而Hsp25、Hspb2、Hspb4、Hspb10、HO-1在PND7、PND21实验组所有雄性子鼠阴茎中的表达均低于对照组。实验组雄性子鼠阴茎中Hsp22在PND7的表达和对照组无差异，但在PND21的表达则高于对照组。Hspb7在PND7实验组中的表达高于对照组，而在PND21实验组中的表达则低于对照组。

3 讨论

sHsps是Hsps中最大的家族之一，目前已知小鼠的sHsps成员有：Hsp25、Hsp27/p27/HspB1、HspB2/ MKBP（myotonic dystrophy kinase-bind-protein）、HspB3、α，A- crystallin /HspB4、α，B-crystallin /HspB5、Hsp20/ HspB6、cvHsp/HspB7、Hsp22/H11/HspB8、HspB9、HspB10（the sperm outer dense fiber 1 protein，ODFP）和HO-1［3］。研究证明sHsps和胚胎发育有关系［6］，我们在研究全反式视黄酸致小鼠胚胎短肢模型时发现sHsps中的Hsp25、HspB2、HspB3、HspB7、Hsp20、HspB9、HspB10可能和小鼠肢发育有关［3］，它们的表达降低可能导致肢的畸形；而Hsp32、Hspb4、Hspb10在腭裂发生中可能主要起应激保护反应，Hspb5、Hspb9可能与腭裂的发生有关［4］。

氟他胺在临床上是一种抗肿瘤药，常用于治疗前列腺癌或良性前列腺肥大；它无任何激素样作用，但有较强的抗雄激素作用。研究发现该药可以导致鼠类隐睾、尿道下裂等雄性生殖系统异常发生，因此常用于雄性动物生殖系统异常的造模［7，8］。本研究发现，于孕期给予母鼠足够剂量的氟他胺可致部分雄性小鼠在哺乳期（出生后到PND21）AGD异常，和其他研究者的发现一致。

我们发现，所有的sHsps在两个时点的阴茎组织中均有表达，说明sHsps在胚胎发育中的保守性。实验组Hsp27、Hspb3、Hspb5、Hsp20、Hspb9在哺乳期小鼠阴茎组织中较对照组高，提示这些基因在小鼠阴茎发育中可能起应激保护作用。实验组Hsp22仅在PND21高于对照组，而PND7则无差异，提示其在断乳前后可能在阴茎发育中起应激保护作用。在PND7、PND21实验组Hsp25、Hspb2、Hspb4、Hspb10、HO-1的表达均低于对照组，提示这些基因可能和哺乳期小鼠阴茎发育有关。实验组中的Hspb7在PND7表达高于对照组，而在PND21则低于对照组，提示该基因可能是小鼠阴茎发育中的重要基因。由于哺乳期子鼠主要吃母乳，极少进食外界实物，因此我们认为sHsps的这些变化主要是子鼠在宫内接触到的、和/或母乳中残留的氟他胺导致的。

上述结果提示某些sHsps表达的异常改变与雄性小鼠生殖器异常发生有关，为进一步研究sHsps在阴茎发育过程中的功能提供了一些研究基础，也进一步说明sHsps和发育有关。

［1］ McIntyre BS, Barlow NJ, Foster PM. Androgen-mediated development in male rat offspring exposed to flutamide in utero: permanence and correlation of early postnatal changes in anogenital distance and nipple retention with malformations in androgen-dependent tissues. Toxicol Sci.2001; 62(2): 236-249.

［2］ Shi W, Xu G, Wang C, Sperber SM, Chen Y, Zhou Q, Deng Y, Zhao H. Heat shock 70-kDa protein 5(Hspa5) is essential for pronephros formation by mediating retinoic acid signaling. J Biol Chem.2015; 290(1): 577-589.

［3］ Yan Z, Wei H, Ren C, Yuan S, Fu H, Lv Y, Zhu Y, Zhang T. Gene expression of Hsps in normal and abnormal embryonic development of mouse hindlimbs. Hum ExpToxicol.2015; 34(6): 563-574

［4］ 朱勇飞, 朱江波, 周宏元, 张天宝. sHsps在小鼠正常腭发育和腭裂发生过程中的表达［J］. 卫生研究, 2005, 34(3): 293-297.

［5］ Stams WA, den Boer ML, Beverloo HB, Meijerink JP, Stigter RL, van Wering ER, Janka-Schaub GE, Slater R, Pieters R. Sensitivity to L-asparaginase is not associated with expression levels of asparagine synthetase in t (12; 21) + pediatric ALL［J］. Blood, 2003, 101(7): 2743-2747.

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［8］ 赵丹, 何大维, 张永波, 等. 胚胎期氟他胺暴露对SD大鼠支持细胞增殖和成熟的影响［J］.2012, 32(8): 505-508.

Change of expressionof sHspsin mouse penis induced by flutamide

Tang Jia-long, He Ming, He Meng-ru, Liu Hao, Li Jin-qi, ZengTian-xin, Zhu Yong-fei，Liu Qiang
(Department of preventive medicine, School of medicine, Hunan normal university, Changsha 410013, China)

Objective To study the expression of sHsps in mouse penis with hypospadias induced by flutamide. Methods ICR pregnant mice were divided randomly into the treatment and the control groups, which were 16 for each. Flutamide suspension in maize oil was administered per os to the treatment group on 12d (gestational day 12, GD12) -GD19 at a daily dose of 80mg/kg/day, whereas the same dose of maize oil was fed to the control group. The male offspring of 8 dams were selected on postnatal 7 and 21 days (PND7, PND21) in both groups respectively. And one of them of the different mothers in the control group was picked out randomly, while twowere selected from the treatment group randomly, for one wasnormal anogenital distance (AGD) and another abnormal AGD. And furthermore, the relative expression abundance of the sHsps of all the samples was measured by real-time quantity reverse transcript polymerase chain reaction (qPCR). Results In both groups, sHsps were found expressed in the mice penises on PND7 and PND21. Except there was no difference of the expression of Hspb9 between the AGD “normal” male offspring in the treatment group and that of the control group on PND7, expression of Hsp27, Hspb3, Hspb5, Hsp20andHspb9 in the treatment group on PND7 and PND21 was higher than that of the control group. The expression of Hsp25, Hspb2, Hspb4, Hspb10 and HO-1 on PND7 and PND21 in the treatment group was lower than that in the control group. The expression of Hsp22 in both groupshad no difference on PND7, but it was higher in the treatment group than the control group on PND21. The expression of Hspb7 in the treatment group on PND7 was higher than that in the control group, while lower on PND21. Conclusion During mouse penisdeveloping, Hsp25, Hspb2, Hspb4, Hspb10 and HO-1 may be related to the abnormal development, and Hspb7was possibly a gene with important role, whileHsp27, Hspb3, Hspb5, Hsp20, Hspb9 and Hsp22 maybe played a protective effect.

small heat shock proteins (sHsps); flutamide; penis

R114

A

1673-016X（2017）02-0026-04

2016-12-30

湖南省科技计划项目课题（2015SK2036）；湖南师范大学本科生创新项目（2016123）

柳强，E-mail:653488726@qq.com