酶转化在淫羊藿苷提取中的应用

富盈昕,刘春莹,郭美娟,赵 耀,金凤燮,鱼红闪

(大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034)

酶转化在淫羊藿苷提取中的应用

富盈昕,刘春莹,郭美娟,赵 耀,金凤燮,鱼红闪*

(大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034)

目前生产淫羊藿苷的过程中,其副产物朝藿定A、B、C等黄酮未被利用好。筛选出了将淫羊藿苷废渣中朝藿定A、B、C等黄酮转化成淫羊藿苷的A.sp.y39菌酶,将其应用于以淫羊藿提取物为原料制备淫羊藿苷的工艺。将150 g西安岳达淫羊藿提取物,溶解于60%乙醇、经D-280脱色柱脱色、结晶得到30.5 g淫羊藿苷;其废渣朝藿定A、B、C混合黄酮,经A.sp.y39菌酶转化,又得到16.6 g淫羊藿苷。共得到纯度90%以上的淫羊藿苷47.1 g;淫羊藿苷的提取率由传统的20.3%提高到31.4%;相比于传统方法,淫羊藿苷的提取率提高了50%以上。本文为节约淫羊藿资源提供了依据。

淫羊藿提取物,淫羊藿黄酮苷酶,淫羊藿苷,朝藿定A、B、C

淫羊藿为小檗科(Berberidaceae)淫羊藿属(EpimediumL.)多年生草本植物,在我国分布的种类有40余种。中国药典(2010年版)规定,淫羊藿(EpimediumbrevicornumMaxim)、箭叶淫羊藿(EpimediumsagittatumMaxim)、柔毛淫羊藿(EpimediumpubescensMaxim)、朝鲜淫羊藿(EpimediumkoreanumNakai)四种淫羊藿地上部分,可用于中草药。淫羊藿具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效[1],其主要有效成分是淫羊藿黄酮,现已发现70余种淫羊藿黄酮,淫羊藿中80%～90%以上的黄酮为淫羊藿苷(Icariin)、朝藿定A(Epimedin A)、朝藿定B(Epimedin B)、朝藿定C(Epimedin C);其中50%以上为淫羊藿苷,其他40%左右的黄酮为朝藿定A、B和C[2]。淫羊藿中主要黄酮的结构如图1所示。

图1 主要淫羊藿黄酮的结构Fig.1 Common epimedium flavonoids

表1 常见的淫羊藿黄酮Table 1 Common epimedium flavonoids

国内淫羊藿提取物的质量,以淫羊藿苷含量来表示[3-4]。淫羊藿苷具有防抑郁[5]、抗肿瘤[6]、抗氧化和增强机体免疫力[7]等功能,也具有抗皮肤老化、抗皱纹、美白等功能[8]。只有一个糖基的淫羊藿次苷或戊糖基苷元的活性则更高[9]。

目前虽可利用大孔树脂吸附法或制备色谱分离法等对少量黄酮进行分离[10-14],但该操作复杂、产业化成本高;淫羊藿苷的提取方法较多[15]。也有利用酶转化淫羊藿苷制备淫羊藿次苷、苷元的报道[16-17],但生物转化制备淫羊藿苷的研究报道很少。

市销的淫羊藿提取物中除了淫羊藿苷之外,还含有朝藿定A、B和C黄酮;为了提高从市销的淫羊藿提取物提取淫羊藿苷的提取率,本文首先筛选了产淫羊藿黄酮苷酶微生物，利用其酶,以市销的淫羊藿提取物为原料,分离提取淫羊藿苷,并利用酶转化法将废渣中的朝藿定A、B和C(主要成分)转化为淫羊藿苷,提高淫羊藿苷的提取率,为节约淫羊藿资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种Aspergillussp.y39、Aspergillussp.y90、Aspergillussp.y48 由本实验室从大曲中分离得到;淫羊藿苷、朝藿定A、B、C标准品 南京广润生物制品有限公司;淫羊藿提取物(淫羊藿苷质量分数为20%) 北京珅奥基医药科技有限公司、吉林省宏久生物科技股份有限公司、西安岳达植物科技有限公司产品;芦丁 南京泽朗医药科技有限公司产品;G60 F254薄层层析板 德国Merck公司;D-280大孔树脂、硅胶(300～400目) 天津南开大学试剂厂;乙腈(色谱级) 美国天地(TEDIA)公司;甲醇等其他试剂 均为分析纯(纯度大于99.5%),天津科密欧化学试剂开发中心。

Waters 2695高效液相色谱分析仪、Waters 2996紫外检测器 美国Waters公司;色谱柱Kromasil C18柱(5 μm,φ250 mm×4.6 mm) 大连中汇达科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 废渣淫羊藿混合黄酮制备 将淫羊藿提取物溶解于10倍重量体积的60%乙醇溶液中,上样至与溶液等体积的D-280大孔脱色树脂柱,反复吸附3～4次;再用约12倍柱体积60%乙醇溶液洗脱,减压浓缩、待大量淫羊藿苷沉淀析出,真空抽滤沉淀,用50%冰冻乙醇溶液洗涤2次,干燥,得到第一批淫羊藿苷。

其母液减压浓缩,溶解于适量的50%乙醇溶液,静置1 d后有淡黄色淫羊藿苷沉淀析出;真空抽滤,再用50%冰冻乙醇溶液洗涤,干燥,得到第二批淫羊藿苷。

其母液再经D-280大孔树脂柱脱色、减压浓缩、干燥,得到废渣淫羊藿混合黄酮,用于转化制备淫羊藿苷。

1.2.2 淫羊藿黄酮苷酶菌种的筛选 酶液的制备[18]:分别将A.sp.y39、A.sp.y90、A.sp.y48菌株,在含有0.3%淫羊藿混合黄酮和0.01%芦丁的4%麦汁培养基中,30 ℃下摇床培养6～7 d,离心除菌、加入3倍体积甲醇,过夜、沉淀酶蛋白,离心收集酶蛋白沉淀,溶解于1/10培养液体积的0.02 mol/L、pH5.0醋酸缓冲液,离心(7000 r/min,8 min)除渣,得到均有淫羊藿黄酮苷酶活力的三种酶液。

三种酶液分别与淫羊藿混合黄酮反应:3 mL各酶液与等体积的7%质量浓度的淫羊藿混合黄酮溶液(用0.02 mol/L、pH5.0的醋酸缓冲液配制)混合,在45 ℃下摇床反应,分别在3、6、9、12 h取样,以薄层层析法(TLC法)检测反应进行程度,确定淫羊藿混合黄酮转化为淫羊藿苷的最佳产酶菌种。

1.2.3 酶转化废渣制备淫羊藿苷 将废渣淫羊藿混合黄酮用0.02 mol/L、pH5.0醋酸缓冲液配制成7%质量浓度的底物溶液,与等体积酶液混合,45 ℃下搅拌反应,在反应3、6、9、12 h时取样,用TLC法检测反应程度;若反应完全,加入3倍体积甲醇(纯度大于99.5%),静置过夜、离心(7000 r/min,8 min)收集上清,经D-280树脂脱色、减压浓缩、干燥,得到淫羊藿苷含量高的反应物。将反应物溶解于其重量3倍的50%乙醇,静置1 d后有淡黄色淫羊藿苷沉淀析出,真空抽滤、用50%冰冻乙醇溶液洗涤、干燥,得到酶转化的淫羊藿苷。

1.2.4 淫羊藿黄酮的检测 用薄层层析(TLC)法和高效液相色谱(HPLC)法检测淫羊藿黄酮。

TLC法:用毛细管吸取样品溶液,点样于TLC板上,每个点相距0.4 cm,依照样品浓度确定点样次数;在展开剂V(乙酸乙酯)∶V(丁酮)∶V(甲醇)∶V(水)=8∶7∶1∶1中展开、吹干,254 nm紫外线下观察。TLC板中各淫羊藿黄酮含量比例,用Bandscan软件(Glyko Inc.,1998)分析[19]。

HPLC法:称取标准品各2 mg,淫羊藿提取物、酶反应产物等样品各4 mg,分别溶于10 mL的50%乙醇中,制成0.2 mg/mL标准品溶液、0.4 mg/mL样品溶液,经0.45 μm膜过滤,待用。流动相,乙腈(A)-水(B):0～8 min,17% A～27% A;8～32 min,27% A,32～60 min,27% A～85% A;60～70 min,85% A,70～80 min,85% A～90% A;进样量,10 μL;柱温,35 ℃;体积流量,1.0 mL/min;检测波长,273 nm。

2 结果与讨论

2.1 市销的淫羊藿提取物原料的分析

用HPLC法对三种市销淫羊藿提取物(淫羊藿苷含量均为20%)进行检测,结果如图2所示。

图2 市销的淫羊藿提取物的HPLC图Fig.2 The HPLC of epimedium extract注:1,朝藿定A;2,朝藿定B;3,朝藿定C;4,淫羊藿苷。

图2中各淫羊藿黄酮的峰面积比例,可视为质量分数的含量比例。北京珅奥基公司淫羊藿提取物中,朝藿定A、B、C和淫羊藿苷的质量分数比约为6∶11∶25∶58;西安岳达公司淫羊藿提取物中上述四种物质的质量分数比约为5∶19∶19∶57;吉林宏久公司淫羊藿提取物中上述四种物质质量分数比则为6∶8∶25∶61。

由此可见,市销的淫羊藿提取物中,淫羊藿苷和朝藿定A、B、C的含量比例约为60∶40,除了含有20%的淫羊藿苷,还含13%～14%左右的朝藿定A、B、C。

2.2 产淫羊藿黄酮苷酶的微生物筛选

为了充分利用上述淫羊藿黄酮,研究废渣生物转化,分别对A.sp.y39、A.sp.y90、A.sp.y48三种菌株所产的酶进行研究。结果表明,三种菌所产的酶均能水解淫羊藿黄酮,最佳产酶条件均为30 ℃下摇床培养6～7 d。

预实验结果表明西安岳达公司淫羊藿提取物酶反应效果好,所以将三种菌所产的酶液分别与西安岳达公司淫羊藿混合黄酮反应,在3、6、9、12 h取样,进行TLC检测,结果如图3所示。用Bandscan软件对图3 TLC板中淫羊藿黄酮的含量比例进行分析,其结果(取三次实验平均值)如表1所示。

图3 不同菌所产的酶对朝藿定混合黄酮的转化Fig.3 Conversion of epimediun flavonoids of second mother solution in different enzyme-reaction time注:1,淫羊藿苷元标准品;2,淫羊藿苷标准品;3,朝藿定A标准品;4,朝藿定B标准品;5,朝藿定C标准品，6:淫羊藿次苷I、II标准品，Y:淫羊藿提取物原料；S,淫羊藿苷分离后的母液黄酮；母液黄酮反应时间:a、b、c、d依次为3、6、9、12 h。

表1 不同菌酶、不同反应时间下各淫羊藿黄酮含量(%)Table 1 The epimedium flavonoids content in different enzyme-reaction time(%)

从图3和表1可以看出,A.sp.y39菌酶与淫羊藿混合黄酮反应6 h,朝藿定A、B、C明显减少,淫羊藿苷明显增加;反应9 h和12 h,淫羊藿苷质量含量分数从原料的56.5%,提高到85%～86%,而朝藿定A、B、C含量降低。说明,A.sp.y39菌酶能水解朝藿定A的末端3-O-葡萄糖基、朝藿定B的末端3-O-木糖基、朝藿定C的末端3-O-鼠李糖基,转化为淫羊藿苷。因此,该酶适合于从朝藿定A、B、C制备淫羊藿苷。

A.sp.y90菌酶与混合黄酮反应3 h,有淫羊藿次苷生成;反应12 h,主要产物为淫羊藿次苷,其含量比例达48%,产物淫羊藿苷含量比例只有21%。说明,A.sp.y90菌酶不仅水解朝藿定A、B、C的末端3-O-糖基,得到淫羊藿苷,还进一步水解一个淫羊藿苷糖基,得到淫羊藿次苷。因此,该酶适合于从朝藿定A、B、C制备淫羊藿次苷。

A.sp.y48菌酶与混合黄酮反应12 h,主要产物是淫羊藿苷元和淫羊藿次苷,其含量比例分别为43%和31%。说明,A.sp.y48菌酶不仅能水解朝藿定A、B、C的末端3-O-糖基,得到淫羊藿苷,还进一步水解一个淫羊藿苷糖基,得到淫羊藿次苷,再水解一个淫羊藿次苷糖基,得到淫羊藿苷元。因此,该酶适合于从朝藿定A、B、C制备淫羊藿苷元和淫羊藿次苷。

综上,从朝藿定A、B、C转化制备淫羊藿苷的最佳产酶菌种为A.sp.y39,应用于如下实验。

2.3 从淫羊藿提取物分离淫羊藿苷及其废渣

利用D-280大孔树脂分离法、结晶法,以各公司提供的淫羊藿提取物为原料,制备淫羊藿苷,并得到主要含朝藿定A、B、C的废渣。

分别从北京珅奥基公司淫羊藿提取物、吉林宏久公司、西安岳达公司淫羊藿提取物中,分离淫羊藿苷,其母液经脱色、浓缩、干燥,可得废渣,结果如表2所示。

表2 淫羊藿苷及其废渣含量及淫羊藿苷得率Table 2 Content of icariin and its waste offscum and the yield of icariin

从表2可知,从100 g北京珅奥基公司淫羊藿提取物中得到20.5 g淫羊藿苷(纯度90%以上),得率为20.5%;其母液经脱色、浓缩、干燥得到30.8 g废渣,其中含朝藿定A、B、C及其他黄酮类物质。从100 g吉林宏久公司淫羊藿提取物,得到20.3 g淫羊藿苷(纯度90%以上),得率为20.3%;从母液得到28.9 g废渣,其中含朝藿定A、B、C及其他黄酮类物质。从150 g西安岳达公司淫羊藿提取物,得到30.5 g淫羊藿苷(纯度90%以上),得率为20.3%;从母液得到52 g废渣,其中含朝藿定A、B、C及其他黄酮类物质。

由此可见,从各市销的淫羊藿提取物(淫羊藿苷含量20%)中,均可以分离得20%左右的淫羊藿苷;其母液废渣经脱色干燥,可得到约30%重量得率的废渣。进一步研究酶转化上述废渣,制备淫羊藿苷。

2.4 分离淫羊藿苷及其废渣酶转化制备淫羊藿苷的批量实验

预实验结果表明西安岳达公司淫羊藿提取物酶反应效果好,因此以下采用西安岳达公司的提取物为原料进行实验研究。将150 g西安岳达公司淫羊藿提取物,溶解在1500 mL的60%乙醇溶液中,上样于等体积D-280大孔脱色树脂柱,反复吸附3～4次,用12倍柱体积60%乙醇溶液洗脱,洗脱液减压浓缩、沉淀真空抽滤,再用50%冰乙醇洗沉淀、干燥,得到第一批淫羊藿苷20.8 g;经HPLC检测(图略),纯度90%以上。

其母液(第一次)再经D-280大孔树脂吸附脱色、减压浓缩、干燥,得到母液总黄酮73 g;经HPLC检测,淫羊藿苷和朝藿定A、B、C含量比例为6.65∶21.2∶24.8∶47.4。

由此可知,第一次淫羊藿苷结晶过程中,淫羊藿苷含量(HPLC峰面积比)从原料的56.5%,下降到47.4%。但母液总黄酮中还含有大量的淫羊藿苷,需进行第二次结晶分离。向其母液总黄酮中,加入240 mL的50%乙醇,使朝藿定A、B、C溶解,静置1 d后将沉淀真空抽滤,再用50%冰冻乙醇溶液洗2次,干燥,得到第二批淫羊藿苷9.7 g,经HPLC检测,纯度90%以上。

其母液(第二次)再经D-280大孔树脂吸附脱色、减压浓缩、干燥,得到废渣52 g,经HPLC检测,朝藿定A、B、C和淫羊藿苷质量分数比为10.5∶18.9∶44.2∶26.4。从淫羊藿提取物分离淫羊藿苷过程中,母液中黄酮组成的变化,如表3所示。

表3 淫羊藿黄酮的组成比例(%)Table 3 The epimedium flavonoid composition radio(%)

从表3可知,淫羊藿苷提取过程中,淫羊藿苷含量从原料中的56.5%降为26.4%,不能再结晶获得淫羊藿苷。其废渣母液中朝藿定A、B、C和淫羊藿苷质量分数比为10.5∶18.9∶44.2∶26.4,即朝藿定A、B、C含量比例约为74%。

因此,利用酶转化法,将废渣母液中朝藿定A、B、C定向转化为淫羊藿苷,提高其得率。52 g的上述第二次结晶后的母液废渣,酶转化9 h时,其80%以上的朝藿定转化为淫羊藿苷。再经D-280大孔树脂分离、结晶,得到酶转化的淫羊藿苷16.6 g,经HPLC检测(图4),其纯度达90%以上。

由此,从150 g西安岳达公司的淫羊藿提取物经D-280树脂柱脱色分离、2次结晶,得到含量90%以上的淫羊藿苷30.5 g,原料重量得率为20.3%,还得到52 g废渣;经酶转化、分离得到含量90%以上的淫羊藿苷16.6 g,重量得率为11.1%;三次共得到纯度90%以上的淫羊藿苷47.1 g,淫羊藿苷的得率由20.3%提高到31.4%。

图4 淫羊藿苷产品HPLC图谱Fig.4 HPLC chromatogram of Icariin product

3 结论

市销的淫羊藿提取物中,除了含20%淫羊藿苷外,还含有13%～14%左右的朝藿定A、B、C,为了利用这部分资源,研究了A.sp.y39、A.sp.y90、A.sp.y48三种菌所产酶对朝藿定A、B、C的水解作用,确定最佳产酶菌种为A.sp.y39。

以150 g市销的西安岳达公司淫羊藿提取物(淫羊藿苷含量20%)为原料,经脱色、两次结晶,得到淫羊藿苷30.5 g(得率为20.3%)及主要含朝藿定A、B、C的废渣52 g;利用A. sp.y39菌所产酶,将废渣中的朝藿定A、B、C转化成淫羊藿苷16.6 g(得率为11.1%),淫羊藿苷的得率由传统方法的20.3%提高到31.4%;相比于传统方法,淫羊藿苷的提取率提高了50%以上。本文为淫羊藿黄酮资源有效的利用提供了依据。

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Bioconversion utilization of waste-residue from icarrin extraction

FU Ying-xin,LIU Chun-ying,GUO Mei-juan,ZHAO Yao,JIN Feng-xie,YU Hong-shan*

(College of Biotechnology,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China)

In current domestic situation,the by-products containing with flavonoids such as epimedin A,B,C was not being used during the icarrin production from epimedium extract. In this paper,the enzyme fromA.sp.y 39 strain was filtered for transformating epimedin A,B,C in waste offscum of epimedium extract. The 150 g of the market epimedium extract was dissolved in 60% ethyl alcohol for decoloring by D-280 macroporous resin,and then 30.5 g of icariin was obtained from above discolored epimedium extract by crystallization method. Then,16.6 g of icariin was obtained from the waste offscum containing epimedin A,B and C by the enzyme fromA.sp.y39 strain. Finally,47.1 g of icariin(the purity was over 90%)was obtained from 150 g of epimedium extract by above enzyme transformation methods,the yield of icariin was rised from 20.3% to 31.4%. Compared with the traditional method,the extraction rate of icariin was increased by more than 50%,which provided the basis for saving epimedium resources.

eptimedium extract;epimedium flavonoids;icariin;epimendin A,B,C

2016-09-19

富盈昕(1990-)，女，在读硕士研究生，研究方向：天然产物生物转化，E-mail：735974001@qq.com。

*通讯作者:鱼红闪(1968-)，男，博士，教授，研究方向：天然产物生物转化，E-mail：hongshan@dlpu.edu.cn。

“重大新药创新”科技重大专项(2012ZX09503001-003)；国家高端外国专家项目(GDT20152100019)资助。

TS255.1

A

1002-0306(2017)08-0167-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.024