褪黑素对大鼠腹膜纤维化抑制作用的研究

赵华 高延霞

·实验研究·

褪黑素对大鼠腹膜纤维化抑制作用的研究

赵华 高延霞

目的 探讨褪黑素对大鼠腹膜纤维化的抑制作用及机制。方法 将45只雄性SD大鼠随机分为3组，每组15只。对照组每天给予生理盐水1.0 ml·100 g-1·d-1腹腔注射；模型组每天给予0.1%葡萄糖氯己定1.0 ml·100 g-1·d-1腹腔注射；褪黑素组在模型组基础上每天给予褪黑素5.0 mg·kg-1·d-1溶于0.5 ml 0.9%生理盐水腹腔注射；以上操作均持续14 d。14 d后分别测量3组大鼠的腹膜超滤量，之后处死大鼠并留取大鼠腹膜组织。HE染色观察大鼠腹膜组织形态学变化，免疫组化检测腹膜组织转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)的表达，Western-blot检测腹膜组织p-Smad2/3及Smad7的蛋白表达情况。结果 与对照组比较，模型组大鼠腹膜超滤量减少，腹膜厚度显著增加，且伴有间皮细胞排列紊乱、间皮下胶原纤维沉积、炎症细胞浸润等腹膜纤维化表现，且对TGF-β1及p-Smad2/3、Smad7蛋白的表达显著增加。与模型组比较，褪黑素组大鼠腹膜超滤量改善，腹膜纤维化表现减轻，腹膜组织变薄，对TGF-β1及p-Smad2/3、Smad7蛋白的表达显著减少。结论 褪黑素可在一定程度上抑制大鼠腹膜纤维化进展，其抑制作用通过下调TGF-β/Smad通路的表达实现。

腹膜纤维化；褪黑素；TGF-β/Smad

慢性肾功能不全的发病率正逐年增高，而慢性肾功能不全最终不可避免进展到终末期肾病，需行肾脏替代治疗，现有的肾脏替代治疗方式有腹膜透析、血液透析、肾移植。 而其中肾移植因肾源有限等因素制约，透析治疗成为最主要的肾脏替代治疗方式，其中腹膜透析因较血液透析经济负担轻、安全性高[1-2]，并且能较好的保护残余肾功能、延缓肾脏疾病恶化速度[3-4]而成为一部分患者首先的治疗方式。但随着腹膜透析的延长，因腹膜透析液的生物不相容性、全身微炎症状态、反复发生腹膜炎以及尿毒症毒素等多种因素的共同作用，可以引起腹膜结构和功能的逐渐改变，发生腹膜纤维化，最终导致腹膜超滤功能衰竭，成为影响腹膜透析患者生存率及其被迫退出腹膜透析的主要原因[5-6]。对于抑制腹膜透析相关性腹膜纤维化发生发展，目前临床上没有效治疗措施，仍是亟需解决的问题之一。褪黑素为松果体分泌的一种具有抗炎、抗氧化、抗纤维化等吲哚类神经内分泌激素，已有研究证实，褪黑素对大鼠肝脏纤维化具有抑制作用[7-8]。本实验通过葡萄糖氯己定诱导大鼠腹膜纤维化从而建立腹膜透析大鼠纤维化模型，旨在探讨褪黑素对大鼠腹膜纤维化的抑制作用及其机制。

材料与方法

一、研究对象

雄性SD大鼠45只，6周龄，体质量160～180 g。饲养于青岛大学附属医院动物房，温度(20±2) ℃，湿度50%～55%，12 h交替照明，自由进食水。适应性喂养一周后，进行正式实验。

二、实验分组及干预措施

将45只SD大鼠随机分为3组，每组15只。对照组每天给予生理盐水1.0 ml·100g-1·d-1腹腔注射；模型组每天给予0.1%葡萄糖氯己定1.0 ml·100g-1·d-1腹腔注射；褪黑素组在模型组基础上每天再给予褪黑素5.0 mg·kg-1·d-1溶于0.5 ml 0.9%生理盐水腹腔注射；以上操作均持续14 d。14 d后分别测量3组大鼠的腹膜超滤量，之后处死大鼠并留取大鼠腹膜组织。HE染色观察大鼠腹膜组织形态学变化，免疫组化检测腹膜组织转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)的表达，Western-blot检测腹膜组织p-Smad2/3及Smad7的蛋白表达情况。

三、观察指标

1.组织形态学检测 避开注射部位，沿大鼠腹中线中部两侧取壁层组织1份，固定，常规脱水，石蜡包埋后切片，以二甲苯脱蜡，酒精梯度复水后进行HE染色，光镜下观察大鼠壁层腹膜形态并比较各组腹膜厚度，各组腹膜厚度的测量值即腹膜表面和肌层间的垂直距离平均值。

2.免疫组化检测壁层腹膜TGF-β1的表达 常规切片，将切片浸于二甲苯中30 min、梯度酒精涮洗、自来水冲洗；3%甲醇双氧水20 min灭活内源性酶，将玻片放入抗原修复液中修复，后切片上滴加山羊血清封闭液，室温20 min。切片上滴加一抗，4 ℃过夜，0.1 PBS洗3次×5 min；切片上滴加生物素化二抗(IgG)，37 ℃ 20 min，0.1 PBS洗3次×5 min；切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37 ℃ 20 min，0.1 PBS洗3次×5 min； DAB显色；苏木素复染细胞核；中性树脂封片；显微镜观察、显微照相。应用Image-ProPlus 6.0图像分析系统将阳性强度量化为平均光密度值。

3. Western-blot检测脏层腹膜p-Smad2/3及Smad7的蛋白表达 ①制备SDS-PAGE 凝胶；②制备电泳样品：取大鼠脏层腹膜组织，切碎后置于匀浆器中并研磨粉碎，裂解后留取上清液，使用BCA蛋白质定量试剂盒对留取的上清液进行蛋白质定量测定，加入适量缓冲液混匀后进行离心，收集上清液；③电泳；④转膜；⑤封闭；⑥一抗孵育：将PVDF膜置于稀释好的一抗(p-Smad2/3抗体、Smad7抗体)中，室温孵育1 h后，弃去一抗液， PVDF在TBST溶液中洗涤3次，每次5 min，以洗净游离的膜表面一抗；⑦将PVDF膜置于稀释好的二抗中，室温中孵育1 h后，弃去二抗液，PVDF膜在TBST溶液中洗涤3次，每次洗涤5 min；⑧蛋白检测：将ECL试剂盒中的A、B液按比例混合覆盖在PVDF膜表面，置于暗盒中，并进行曝光、拍照、扫描，最终测出灰度值。

四、统计学分析

采用SPSS 12.0统计学软件进行数据处理，计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、大鼠腹膜超滤情况

模型组大鼠死亡1只，对照组、褪黑素组未见死亡。模型组、褪黑素组成功建立腹膜纤维化大鼠模型，腹膜超滤量分别为(-1.23±1.90) L/min、(2.42±0.36) L/min，对照组腹膜超滤量(3.52±1.05) L/min。与对照组比较，模型组、褪黑素组大鼠腹膜超滤量明显降低(P<0.05)；褪黑素组大鼠腹膜超滤量和模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

二、壁层腹膜组织HE染色情况

光镜下观察大鼠壁层腹膜形态：对照组大鼠壁层腹膜组织很薄，间皮细胞排列整齐；而模型组腹膜较对照组明显增厚，间皮细胞排列紊乱、脱落，间皮下胶原纤维沉积、基质增厚、炎症细胞浸润；褪黑素组较模型组腹膜变薄，以上形态学表现亦减轻。对照组、模型组、褪黑素组大鼠壁层腹膜厚度分别为(18.01±3.27) μm、(50.11±3.97) μm、(29.42±4.19) μm，三者间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。(图1)

三、免疫组化检测壁层腹膜TGF-β1的表达

对照组大鼠壁层腹膜组织TGF-β1仅有少量表达或几乎无表达，模型组表达明显增加(P<0.05)；褪黑素组表达较对照组增加(P<0.05)，但较模型组表达受抑制(P<0.05)。对照组、模型组、褪黑素组大鼠TGF-β1平均光密度值分别为0.004 2±0.000 5、0.035 9±0.001 9、0.013 2±0.002 2，三者间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。(图2)

四、Western-blot检测脏层腹膜p-Smad2/3及Smad7的蛋白表达

与对照组相比，模型组大鼠腹膜组织对p-Smad2/3及Smad7的表达明显增加(P<0.05)，褪黑素组大鼠腹膜组织对p-Smad2/3及Smad7的表达较模型组减少(P<0.05)。(图3)

讨 论

慢性肾脏病的患病率正逐年提高，已成为重要的公共卫生问题，据统计我国慢性肾脏病的发病率现已高达10.8%，而进展为终末期肾病的患者已高达200万左右[9]，而肾脏替代治疗为终末期肾病患者唯一有效的治疗方法。目前肾脏替代治疗方案有腹膜透析、血液透析、肾移植，而腹膜透析因其经济、有效，且能较好的保护残余肾功能、延缓肾脏疾病恶化得到广泛应用。有研究显示至2014年底全国范围的血液净化病例信息登记系统内共登记维持性腹膜透析患者55 373例，平均以每年新增7 891例速度增长,增长率为20.8%[10]。腹膜透析正在得到更广泛认可，但在腹膜透析过程中，由于透析液的生物不相容性、腹膜透析相关性腹膜炎、全身微炎症状态以及尿毒症毒素等，共同引起腹膜的改变进而启动腹膜纤维化，腹膜纤维化会导致超滤衰竭，成为患者退出腹膜透析的主要原因并亟需解决的问题之一。

图1 各组大鼠壁层腹膜HE染色情况(×400)

图2 各组大鼠壁层腹膜TGF-β1表达情况(×400)

图3 各组大鼠壁层腹膜TGF-β1表达情况(×400)

腹膜纤维化的发生发展过程涉及到众多细胞因子及组织因子，例如TGF-β1、结缔组织生长因子、血管内皮生长因子等。众多研究显示腹膜TGF-β1是透析相关性腹膜纤维化发生发展的关键因子[11]，TGF-β1与受体结合后，通过Smad蛋白将信号传导至细胞内，Smad蛋白分成3个亚家族，分别为R-Smads(受体激活型Smads)、I-Smads (抑制型Smads)以及共Co-Smads(同通路型Smads)。R-Smads中Smad2、Smad3被磷酸化而活化后，可与Co-Smads结合，参与TGF-β1/Smad通路的信号转导过程。而I-Smads中Smad7发挥相反的作用，抑制TGF-β1/Smad通路的信号转导过程[12]。褪黑素为松果体分泌的具有广泛生理作用的一种吲哚类神经内分泌激素，具有强大的抗炎、抗氧化作用[13-14]。褪黑素可以下调炎症反应过程中的重要启动因子之一核因子B的表达，发挥抗炎作用，与细胞膜及细胞核等部位的自身受体结合，使抗氧化酶的活性增强并限制自由基的生成而发挥抗氧化作用。有研究显示褪黑素能够一定程度抑制大鼠肝脏、肺、肾脏的纤维化进展。基于褪黑素的上述作用，本实验通过葡萄糖氯己定腹腔注射构建大鼠建立大鼠腹膜纤维化模型[15]，探讨褪黑素对腹膜纤维化大鼠的保护作用及其机制。

本实验中大鼠给予褪黑素干预后，腹膜组织病理学改变及腹膜对TGF-β1、p-Smad2/3的表达均减少，故认为褪黑素能够通过减少TGF-β1的表达，通过抑制TGF-β1/Smad通路表达而抑制葡萄糖氯己定诱导的大鼠腹膜纤维化的进展。Smad7作为TGF-β信号通路的负性调控蛋白，发挥与Smad2/3相反的作用，与Smad2/3竞争TβRⅠ(Ⅰ型受体)，并且可以通过E3-泛素连接酶转移至活化的TβRⅠ使其受体降解，从而抑制Smad2/3的磷酸化过程。模型组大鼠予腹腔注射葡萄糖氯己定，TGF-β1/Smad通路被激活，腹膜发生纤维化启动，Smad7表达增多以对抗腹膜纤维化。而本研究发现，褪黑素组大鼠予褪黑素干预后，其腹膜纤维化程度减轻，但对腹膜纤维化其抑制作用的Smad7蛋白的表达也减少，考虑Smad7蛋白的减少可能与TGF-β1/Smad通路被抑制相关，其具体机制仍待进一步研究。

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Inhibitory effect of melatonin on peritoneal fibrosis in rats and its mechanism

ZHAOHua,GAOYan-xia.

DepartmentofUrology,AffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266021,China

GAOYan-xia,Email:gaoyanxia31@163.com

Objective To investigate the inhibitory effect and the mechanism of melatonin on peritoneal fibrosis in rats.Methods Forty-five male SD rats were randomly divided into 3 groups (n=15 each). The control group was intraperitoneally injected with normal saline (1.0 ml·100 g-1·day-1). Model group was intraperitoneally injected with 0.1% chlorhexidine gluconate (1.0 ml·100 g-1·day-1). Model and melatonin group was intraperitoneally injected with 0.1% glucose (1.0 ml·100 g-1·day-1) and melatonin (5.0 mg·kg-1·day-1) dissolved in 0.5 ml 0.9% normal saline simultaneously. The ultrafiltration volume was measured after 14 days. The rats were then sacrificed and the peritoneal tissue was obtained. HE staining was used to observe the morphological changes of peritoneal tissue. The expression of TGF-β1 in parietal peritoneum was detected by immunohistochemistry. Western blotting was applied to detect the expression of p-Smad2/3 and Smad7 proteins in visceral peritoneum.Results As compared with the control group, the peritoneal ultrafiltration volume in the model group was decreased, and the peritoneal thickness was significantly increased. In the model group, peritoneal fibrosis presented as mesothelial cell disorder, subcutaneous collagen fiber deposition, inflammatory cell infiltration, etc. What’s more, the expression of TGF-β1, p-Smad2, Smad7 protein was significantly increased. As compared with the model group, the peritoneal ultrafiltration volume in the model+melatonin group was improved, the peritoneal fibrosis was alleviated, the peritoneal tissue was thinned, and the expression of TGF-β1, p-Smad2/3 and Smad7 protein was significantly decreased.Conclusions Melatonin can inhibit the progress of peritoneal fibrosis in rats, and its inhibitory effect is achieved by down-regulating the expression of TGF-β/Smad pathway.

Peritoneal fibrosis; Melatonin; TGF-β/Smad

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.04.011

266021 青岛，青岛大学附属医院肾内科(赵华)；266036 青岛，山东大学齐鲁医院(青岛)泌尿内科(高延霞)

高延霞，E-mail:gaoyanxia31@163.com

2016-10-13

2017-01-05)