卡介菌多糖核酸对OVA致敏小鼠血清特异性IgE的影响

秦黎静++徐永革++王玉英+彭农++李静

摘 要：目的：以卵白蛋白（OVA）为致敏原建立变态反应模型，通过检测小鼠血清中特异性IgE来明确卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）对致敏小鼠的治疗作用。方法：将小鼠随机分为致敏组、致敏+药物干预组、空白组。采用酶联免疫法检测各组小鼠血清OVA特异性IgE表达，并对各组（除空白组）小鼠发病情况计分。比较各组血清OVA特异性IgE表达水平和发病情况。结果：致敏+药物干预组的小鼠发病得分显著低于致敏组，血清OVA特异性IgE的表达水平显著高于空白组、低于致敏组。结论：腹腔致敏卵白蛋白使小鼠血清OVA特异性IgE升高，以BCG-PSN（卡舒宁）治疗使OVA特异性IgE降低。可通过检测小鼠血清中特异性IgE确定卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）对致敏小鼠的治疗作用。

关键词：卵白蛋白；卡介菌多糖核酸；特异性IgE；模型

中图分类号：R725 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）06-0201-02

卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）是从卡介菌中提取的一种具有免疫调节功能的物质，主要成分是多糖和核酸，具有调节机体免疫水平，增强机体的抗感染和抗过敏能力的作用，经临床应用表明对预防和治疗慢性支气管炎、哮喘、感冒等有较好疗效[1-2]。能通过稳定肥大细胞，封闭IgE功能，减少脱颗粒细胞释放活性物质，以及具有抗乙酰胆碱所致的支气管痉挛作用，达到抗过敏及平喘作用[3]。目前进行的卡介菌多糖核酸注射液效力实验具有致敏原和实验模型不稳定、实验结果带有主观性的现状。本研究以卵白蛋白（OVA）作为致敏原[4]，选择适宜的致敏浓度和激发浓度建立实验动物模型，并通过酶联免疫法检测实验动物血清中OVA特异性IgE水平的变化，确定卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）对致敏小鼠的治疗作用[5-8]。

1 材料和方法

1.1 主要材料

1.1.1 实验材料

BCG-PSN（卡舒宁），批号T-20141101，由成都生物制品研究所有限责任公司提供。

1.1.2 实验动物

健康雌性SPF级 Balb/c小鼠，体重20-22g，购自成都达硕实验动物有限公司。实验前已进行3天适应性喂养。

1.1.3 试剂

卵白蛋白（OVA），批号025K700，购自Sigma公司；Al（OH）3溶液，由成都生物制品研究所有限责任公司细菌性疫苗一室提供；生理氯化钠溶液，购自四川科伦药业股份有限公司；小鼠卵清蛋白特异性IgE（OVA-sIgE）酶联免疫反应试剂盒，购自上海沪震实业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 致敏原及致敏浓度的选择

卵白蛋白的蛋白浓度测定采用微量蛋白检测法（Lowry法），测得蛋白浓度为5mg/ml。用0.4%的Al（OH）3溶液将卵白蛋白稀释至40μg/ml作为致敏原。

1.2.2 腹腔注射致敏模型的建立

将小鼠以含铝佐剂的40μg/ml卵白蛋白致敏，共致敏3次，隔日1次，每只小鼠腹腔注射0.5ml，建立小鼠腹腔注射致敏模型。

1.2.3 激发浓度的选择

从建立的致敏模型组取64只小鼠，随机分为4组，分别为2倍激发组、4倍激发组、8倍激发组、10倍激发组。每组16只小鼠，末次致敏后14d，分别用浓度为80μg/ml、160μg/ml、320μg/ml、400μg/ml的含铝佐剂的卵白蛋白尾静脉注射。注射后各组分别取8只小鼠心脏采血，用Elisa法检测各组小鼠血清中OVA特异性IgE抗体水平，将各组血清检测OD值以excel进行统计，所得结果以均数±标准差（mean±SD）表示。各组另8只小鼠于注射后30min内观察发病情况并计分（计分标准：0.5分-过度兴奋或活动减弱；1.0分-匍匐不起，走路摇摆；2.0分-瘫痪；3.0分-痉挛跳跃或蛙跳、侧卧、呼吸深，在31至60分钟或更长时间后死亡；4.0分-30分钟内死亡）。综合各组小鼠血清中OVA特异性IgE抗体水平和发病情况确定最适激发浓度。

1.2.4 BCG-PSN（卡舒宁）效力实验

（1）致敏：从建立的致敏模型组取32只小鼠，随机分为致敏组、致敏+药物干预组，各16只小鼠。另取8只小鼠作为空白组，以生理氯化钠溶液致敏。

（2）治疗：末次致敏后次日，致敏+药物干预组以BCG-PSN（卡舒宁）治疗7次，隔日1次，每只小鼠腹腔注射1ml BCG-PSN（卡舒宁）。致敏组、空白组以生理氯化钠溶液治疗。

（3）激发：末次治疗后次日，各组均以4倍致敏浓度的卵白蛋白（160μg/ml）尾静脉注射小鼠。

（4）采血及计分：注射后致敏组、致敏+药物干预组各取8只小鼠心脏采血，各组另8只小鼠于攻击后30min内观察发病情况并计分（计分标准见1.2.3）。注射后空白组小鼠全部心脏采血。

1.2.5 小鼠血清中OVA特异性IgE的测定

采用酶联免疫吸附测定（Elisa）方法，按照检测试剂盒说明书，检测各组小鼠血清中的OVA特异性IgE。

1.2.6 实验结果处理

将致敏组、致敏+药物干预组实验得分以Excel进行统计学分析，P<0.05有显著性差异。致敏组、致敏+药物干预组、空白组的血清检测OD值以Excel进行统计，所得结果以均数±标准差（mean±SD）表示，将各组间进行统计学分析，P<0.05有显著性差异。

2 结果

2.1 激发浓度选擇结果

分别以不同浓度的OVA对致敏小鼠进行激发，过敏值1分以上者判为发病。实验显示，2倍激发组的小鼠发病率为75%，4倍激发组、8倍激发组、10倍激发组的小鼠发病率均为100%（表1），4倍激发组、8倍激发组、10倍激发组符合激发浓度的要求。在进行心脏采血的4组中，8倍激发组、10倍激发组分别有2只、3只小鼠在激发后立即死亡，产生血凝，无法采血，只能检测存活小鼠血清中OVA特异性IgE表达的OD值，不能反应两组小鼠血清OD值的真实情况（表2）。因此，综合各组小鼠发病情况及血清OVA特异性IgE表达，确定以40μg/ml卵白蛋白致敏时，最适激发浓度为160μg/ml。

2.2 BCG-PSN（卡舒宁）效力实验结果

统计结果显示，致敏组和致敏+药物干预组的小鼠发病分值具有显著性差异（P=0.033<0.05），且致敏组的累计发病分值高于致敏+药物干预组（表3），说明通过BCG-PSN（卡舒宁）药物干预，对发病小鼠有明显的治疗效果。通过对OD值统计分析可知，致敏組小鼠血清OVA特异性IgE表达较空白组明显升高，两者比较有显著性差异（P<0.05）。而致敏+药物干预组的血清OVA特异性IgE水平较致敏组明显减低，两者比较有显著性差异（P<0.05）。（表4）

3 讨论

IgE是介导I型变态反应的抗体，过敏原特异性IgE可与位于肥大细胞及嗜碱细胞的膜上受体发生特异性结合，当机体再次某过敏原，过敏原连接到上述细胞的膜表面IgE上，导致相关的细胞信号通路被激活，进而释放多种介质，引起靶细胞功能改变而发病，因此，检测特异性IgE水平对i型过敏反应的诊断和过敏原的确定有重要意义[9]。

本实验选用卵白蛋白（OVA）作为致敏原，其免疫原性强，在哮喘动物模型中使用广泛，而铝制剂作为免疫佐剂易致机体IgE产生[10]，故同时加入氢氧化铝作为免疫佐剂，以适宜的致敏浓度建立腹腔致敏模型，并通过实验选择适宜的激发浓度进行BCG-PSN效力实验。目前对该实验的结果判定是通过对激发后小鼠的发病情况计分，比较药物治疗组和生理氯化钠溶液治疗组的得分，P<0.05表示有显著性差异。本次实验结果显示，用BCG-PSN（卡舒宁）治疗的小鼠发病得分显著低于生理氯化钠溶液治疗的小鼠，说明以现行的判定标准，BCG-PSN（卡舒宁）对致敏小鼠有治疗作用。而用BCG-PSN（卡舒宁）治疗的小鼠血清OVA特异性IgE的OD值显著高于空白组、低于致敏组，显示腹腔致敏卵白蛋白使小鼠血清OVA特异性IgE升高，以BCG-PSN（卡舒宁）治疗使OVA特异性IgE降低，证明BCG-PSN（卡舒宁）对致敏小鼠的治疗作用，与现行判定标准得到一致的实验结论。而现行的通过对发病小鼠计分的方式具有很强的主观性，能否用检测血清特异性IgE水平对BCG-PSN效力实验进行优化还需要进一步研究。

参考文献

[1]朱秀丽，张燚.卡介菌多糖核酸的药理特性及临床应用进展[J].中国当代医药，2013，20（3）：19-21.

[2]马煜，陈育智，等.应用卡介菌多糖核酸注射液治疗儿童哮喘的研究[J].临床儿科杂志，2002，20（4）：224-226.

[3]莫碧芳.卡介菌多糖核酸的临床应用[J].临床合理用药杂志，2011，04（3X）：132-133.

[4]赵爱华，贾淑珍，等.卡介菌多糖核酸注射液效力实验动物模型致敏原的选择[J].中国医药生物技术，2009，4（4）：282-284.

[5]迟磊，符州，等.过敏性哮喘大鼠模型的建立[J].重庆医学，2003，32（4）：429-431.

[6]陈子珺.抗过敏实验方法及过敏反应动物模型研究进展[J].云南中医学院学报，2000，23（3）：11-18.

[7]欧阳秋星.哮喘严重程度与血清特异性IgE的关系分析[J].现代医院，2008，8（2）：27-29.

[8]顾一峰，张新民，等.不同免疫次数对大鼠血清总IgE和特异性IgE的影响[J].实用动物与比较医学，2004，（4）：234-235.

[9]尚霞.血清总ige和过敏原特异性检测在过敏性疾病中的临床意义[J].中国保健营养旬刊，2013，23（4）：977-977.

[10]周光炎，主编.分子免疫学.第一版，上海科学技术文献出版社，2002，71.