智利进口种牛乳头瘤病毒的检测与分析

王 昱，唐昌杰，肖红波，聂福平，马 飞，杨 俊，陈冉越，吴 蕊

（1. 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心，重庆 400044；2. 武隆县畜牧兽医局，重庆武隆 408528；3. 唐山出入境检验检疫局，河北唐山 063000）

智利进口种牛乳头瘤病毒的检测与分析

王 昱1，唐昌杰1，肖红波2，聂福平1，马 飞3，杨 俊1，陈冉越1，吴 蕊1

（1. 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心，重庆 400044；2. 武隆县畜牧兽医局，重庆武隆 408528；3. 唐山出入境检验检疫局，河北唐山 063000）

通过临床观察、采样、PCR检测、克隆和测序，对智利进口种牛进行了牛乳头瘤病毒（BPV）检测和基因分型。结果表明，智利进口牛的BPV总体感染率为0.4%，病毒亚型有BPV2和BPV13，其中以BPV2为主，BPV13的感染率仅为0.09%。L基因进化分析表明，BPV智利株和我国BPV的感染情况显著不同，呈现明显的地域特征，两国的BPV2L1基因具有较高的同源性。BPV阳性牛的治疗结果显示，75%左右的阳性牛经外科剪切、抗生素治疗后愈合良好，但仍有部分牛出现新的小疣。调查结果提示：BPV感染并非全为一过性感染；BPV13亚型仍为我国外来亚型，仍需进出口检验检疫部门加强对BPV的检疫。

牛乳头瘤病毒；智利进口奶牛；检测与分析

随着人们生活水平的提高，牛乳及其制品的消费量持续增长。近年来我国养牛业发展迅速，从国外进口架子种牛成为各大乳牛场改善种质资源、提高牛乳产能的重要手段。进口种牛对于丰富我国现有乳牛种群，快速提升生产性状，改善原乳质量，丰富我国牛种基因资源等具有积极意义。目前，我国种牛的主要进口国为智利、新西兰和澳大利亚，引种前的检疫项目主要有结核病、牛病毒性腹泻/粘膜病、副结核、牛流行性地方性白血病、牛传染性鼻气管炎、蓝舌病和赤羽病，但针对不同来源国，检疫项目略有所不同。牛乳头瘤病毒（BPV）感染常因损害皮革质量、影响牛乳品质或引发恶性肿瘤而造成严重经济损失[1]。在产地预检和入境隔离检疫中，BPV感染常常会出现因头颈皮肤疣状物而被剔除。

多年来，天津、河北等口岸从澳大利亚等国进口的奶牛中多次检出BPV[2]。由于BPV通常被认为是自限性疫病，其感染和流行并没有得到足够的重视。因此，对于该病在进口奶牛群体中的多态性和危害水平研究较少。有研究发现，BPV的部分亚型，除了导致明显的皮肤乳头瘤外，还可能导致出现牛生殖道和消化道肿瘤，引起较严重后果[3]。若仅凭肉眼观察，只能发现有明显皮肤疣的BPV阳性动物，而对于乳头瘤存在于消化道、生殖道、尿道、乳腺等内部或隐蔽部位的阳性动物，则很难发现。为此，本文以智利进口种牛作为调查对象，探讨各贸易国流行的BPV亚型和国内牛BPV亚型（1和2型为主）的差异。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

病毒DNA/RNA提取试剂盒（Takara）、深加工食品DNA提取试剂盒（GMO food DNA Extraction Kit）、胶回收提取试剂盒（E.Z.N.A.TMGel Extrection Kit）、质粒提取试剂盒（E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kit）、pMD19-T载体、感受态细胞（DH5α）、营养肉汤（NB）、营养琼脂（NA）、氨苄青霉素、DEPC水、EX Taq 酶（Takara）。

1.2 方法

1.2.1 样本采集及治疗。从河北和天津两处指定隔离场，采集阳性牛的组织及血液样本，冷藏运输到实验室。采集样本时，使用手术剪逐一切除可见皮肤疣，并用碘酒消毒后，喷洒抗生素治疗，1个月后观察康复情况。

1.2.2 DNA提取。将采集的疣块剪碎，分装于1.5 mL离心管中，经液氮冷冻后，用超低温自动研磨仪将样本打碎，放入-80 ℃超低温冰箱备用。对血液样本使用病毒DNA/RNA提取试剂盒提取DNA，对组织样本使用GMO food DNA Extraction Kit提取DNA，方法参照试剂盒说明书。

1.2.3 PCR扩增和测序。将提取的DNA进行PCR扩增，引物为FAP59/FAP64（表1）[12]。普通PCR扩增反应体系和扩增条件为：25 μL Ex Taq Buffer，2 μL FAP59（10 μM），2 μL FAP64（10μM），16 μL灭菌水，5 μL DNA模板；94 ℃ 10 min；45个循环：94 ℃ 90 s、50 ℃ 90 s、72 ℃ 90 s ；72 ℃5 min。取PCR产物5 μL用2%琼脂糖凝胶进行电泳检验，电泳条件为110 V/400 mA，30 min。将目的条带进行胶回收，方法参照胶回收试剂盒说明书。将胶回收产物连接到pMD19-T载体上，反应体系和反应条件为：5 μL Solution I，1 μL pMD19-T，4 μL胶回收产物，16 ℃连接3 h后转化DH5α感受态。阳性菌经M13引物鉴定，提取质粒，进行测序。

表1 检测用引物

1.2.4 序列分析。获得序列后，首先去除两端的质粒序列；然后用NCBI 在线BLAST软件进行分析比对，得到BPV的分型情况。为了探明智利牛和我国本地牛的BPV亚型差异，将智利牛的BPV序列和GenBank中的我国分离株的L1基因序列进行比对分析。通过对L1基因建立系统发育树的方法，分析相互之间的关联性。

2 结果与分析

2.1 观察和治疗情况

在两批智利牛（约4 500头）中观察到19头BPV阳性牛，主要临床表现为凸起于皮肤表面的呈菜花型的疣状物，没有观察到不愿进食或血尿等其他临床症状。在采集阳性组织样本的同时，进行创面消毒和抗生素治疗，1个月后观察发现愈合率大于75%，有 少部分牛在创面以外的皮肤上有新的乳头瘤形成。

2.2 PCR检测情况

全部19份皮肤组织样本的FAP-PCR均为阳性，而对应的血液样本均为阴性。PCR扩增后的DNA片段大小均为470 bp左右，与预定的产物长度一致。产物均成功连接克隆到pMD19-T质粒上（图1、图2）。

图1 引物FAP59/FAP64的PCR扩增结果（1）

图2 引物FAP59/FAP64的PCR扩增结果（2）

2.3 序列分析及比对结果

序列分析表明，在全部19头阳性牛中，有15头感染BPV2型，另外4头感染BPV13型。BPV2的感染率为0.3%，BPV13为0.09%（表2）。

表2 智利牛BPV感染情况

将智利分离株L1基因的序列同国内报道的BPVL1基因序列进行多重比对和系统树分析，结果发现智利的BPV2和我国的BPV2在L1基因上有较高的同源性（图3），但是否存在同源重组和基因交换有待进一步分析。其主要区别在于智利BPV13的分离株数量明显多于我国，且同源性较低。同我国复杂的BPV感染情况相比，智利的牛BPV感染具有一定的地域特征。

3 讨论

图3 L1基因系统发育树（NJ法，Bootstrap值500）

在进口智利牛中采集到的阳性样本以皮肤疣为主，其感染率为0.4%，说明进口前的产地检疫效果有效，大部分阳性牛在境外已被淘汰。75%以上的牛在切掉乳头瘤1个月后不再复发，表明多数病例可以简单治疗康复。部分阳性牛在切除后，仍出现新的小疣，这可能和个体的易感性或免疫状况有关。由此证明，BPV感染并非境外兽医所述的均为一过性感染，不治而愈。值得注意的是，全部BPV阳性牛的血液样本中均无阳性条带，这证明了所采集的BPV感染牛均为局部皮肤感染，而非全身性感染，这也与其无其他临床症状的特征相吻合。实验采集的样本数来自牛的头部、颈部、面部的纤维乳头状瘤体，与现有报道的BPV2和BPV13感染的临床症状相吻合[5]。FAP引物的产物均为BPVL1基因。L1基因的进化分析表明，智利牛的BPV同我国的BPV有显著区别，但在BPV2之间存在较高的同源性，是否暗示有基因水平的重组和交换，需要深入研究。当前，BPV13暂非我国的主要感染亚型，外来亚型的传入和“定殖”可能会让国内的BPV防控难度加大。

综上所述，牛BPV感染主要表现为对皮肤的损伤，大部分阳性牛均能有效控制或治愈。但由于BPV亚型众多，仍需进出口检验检疫部门继续加强检疫，特别要防范外来亚型BPV13的传入，一但发现病畜，应坚决淘汰[6]。此外，应加强研究，开发针对引起全身感染或导致恶性肿瘤的BPV亚型的诊断方法和技术。

[1] 史巧芸，庞峰，杜丽，等. 牛乳头瘤病毒的研究进展[J].中国畜牧兽医，2015，42（6）：1613-1619.

[2] 张鹤晓，刘继 ，张玉忠，等. 从进口牛中检出纤维乳头状瘤[J]. 中国兽医杂志，1992（1）：21.

[3] 王远东，张亚军，杨淑清. 畜禽的肿瘤及其危害[J]. 黑龙江畜牧科技，2000（2）：27-28.

[4] OGAWA T，TOMITA Y，OKADA M，et al. Broadspectrum detection of papillomaviruses in bovine teat papillomas and healthy teat skin[J]. Journal of General Virology，2004，85：2191-2197.

[5] 梁辰，姜晓文，刘旭，等. 牛乳头状瘤的病理学观察及其病毒基因型分析[J]. 中国预防兽医学报，2013（5）：423-425.

[6] 张鹤晓，刘继红，刘环，等. 牛阴茎纤维乳头状瘤的检疫技术及防止传入对策[J]. 检验检疫科学，2002（4）：27-28.

（责任编辑：朱迪国）

Detection and Analysis on Papillomavirus of Breeding Cows Imported from Chile

Wang Yu1，Tang Changjie1，Xiao Hongbo2，Nie Fuping1，Ma Fei3，Yang Jun1，Chen Ranyue1，Wu Rui1
（1. Technical Center for Inspection and Quarantine，Chongqing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Chongqing 400044；2. Wulong Animal Husbandry and Veterinary Bureau，Wulong，Chongqing 408528；3. Tanghan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Tangshan，Hebei 063000）

In this article，by the means of clinical observation，sampling，PCR，clone and sequencing，the detection and genes analysis of bovine papillomavirus（BPV）were conducted towards the imported breeding cows from Chile. Results showed that the overall infection rate of BPV was 0.4%. Two subtypes consisting of BPV2 and BPV13 were detected and confirmed，between the two subtypes，BPV2 was absolutely dominant，while the cattle infected by BPV13 accounted for just 0.09%. The phylogenetic analysis ofL1gene indicated obvious geographical difference in the overall infection status between China and Chile. And the homology of BPV2L1gene was high between strains in the two countries. After treatment for BPV positive cows，75% of them were cured by surgical removal with an attachment of antibiotics. However，small new verrucas still grew up again in some cows. According to the results of investigation，BPV infection didn´t showed transient for all bovines and subtype BPV13 was still exotic for China，hence BPV inspection and quarantine needed to be further strengthened by relevant entry-exist departments.

Bovine papilloma virus（BPV）；cows imported from Chile；detection and analysis

S851.3

：B

：1005-944X（2017）05-0047-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.05.012

国家质检总局2015年度科技攻关项目（2015IK331）