基于形态特征和线粒体12S、Cyt b和ND4基因片段的横斑锦蛇和玉斑锦蛇的关系研究

2017-05-11 01:43:49安小燕干少雄毛晓陶李书彬
四川林业科技 2017年2期
关键词:遗传物种距离

安小燕,黄 燕,丁 利,干少雄,毛晓陶,李书彬

(1.四川省林业科学研究院,四川 成都 610081; 2.西华师范大学生命科学学院珍稀动植物研究所,四川 南充 637009; 3.中科院成都生物研究所,四川 成都 610041;4.天全县林业局,四川 雅安 625500)

基于形态特征和线粒体12S、Cyt b和ND4基因片段的横斑锦蛇和玉斑锦蛇的关系研究

安小燕1,2,黄 燕2*,丁 利3,干少雄1,毛晓陶4,李书彬4

(1.四川省林业科学研究院,四川 成都 610081; 2.西华师范大学生命科学学院珍稀动植物研究所,四川 南充 637009; 3.中科院成都生物研究所,四川 成都 610041;4.天全县林业局,四川 雅安 625500)

本文通过对横斑锦蛇(Elapheperlacea)肌肉线粒体DNA的提取,对其中的3个基因—12SRNA、ND4和细胞色素b进行扩增、测序,与玉斑锦蛇(Elaphemandarinus)及锦蛇属(Elaphe)17个物种的相同基因片段重建系统发育树。系统发育结果表明横斑锦蛇与玉斑锦蛇系统发育关系最近,但是两者不是同一个物种。最后将横斑锦蛇和玉斑锦蛇的外部特点进行对比,发现横斑锦蛇与玉斑锦蛇在形态特征上存在稳定性差异。

横斑锦蛇(Elapheperlacea);线粒体DNA;玉斑锦蛇(Elaphemandarinus);系统发育关系;形态特征

横斑锦蛇(Elapheperlacea)隶属游蛇科(Colubrldae)锦蛇属(Elaphe),是我国四川省西部的特产动物。由美国学者stejneger.L于1929年依据采于雅安的一号雄蛇标本发表的新种。模式标本保存在美国博物馆。近50年未见再有报道,有人认为可能绝灭。1980、1987、1988年先后在汶川县卧龙自然保护区及泸定县海螺沟森林冰川公园获得锦蛇属标本3号。经鉴定为该种,分别保存在四川师范学院(现西华师范大学)生物系和中国科学院成都生物研究所(邓其祥,江耀明,1989)。横斑锦蛇蛇体全长1 m左右,头呈椭圆形,与颈区分不明显,头背具对称排列的大鳞。吻鳞宽大于高,从背面可见部分较多,鼻孔较大,位于前后两枚鼻鳞之间。颊鳞1,眼前鳞1。眼后鳞2,上唇鳞7,2-2-3式,下唇鳞8,前3或4枚切前颏片。背鳞19-19-17行,平滑或中段部分鳞行起棱。肛鳞二分,尾下鳞双行。全长865+194、1055+189、884+146毫米。背面灰色,具有几乎等距排列的黑色横斑.每一横斑占2鳞行,边缘镶有不甚清晰的白色。每两个相邻的横斑在腹面连接成卵圆形环,环内横斑间相隔1-2鳞行,前后两环间相隔3-4鳞行。体背卵圆形环36-37个,尾部9个。头背前部有2黑色横斑,其后为两个前后彼此相连的倒“V”形黑色斑。第一黑横斑位于吻鳞与鼻鳞之间,前鼻鳞至第一上唇鳞而与下唇缘黑点相吻合,第二黑横斑位于前额鳞,经眼上鳞至眼。分为前后2支,前支从眼前鳞到第三、四上唇鳞之间。后支从眼后鳞经前颞鳞斜向第五、六上唇鳞之间。第一倒"V"形黑斑自额鳞,经顶鳞后顾鳞后方向前弯至下唇鳞内侧,第二倒“V”形斑自顶鳞向外斜至颈侧腹面与颈部倒“V”形黑斑连接成第一卵圆形环(胡杰,李艳红等,2002)。至今对横斑锦蛇的研究少之又少,NCBI上还未收录关于横斑锦蛇的任何基因序列。

玉斑锦蛇(Elaphemandarinus)隶属游蛇科锦蛇属(Elaphe),1882年首先被Cantor发现并命名为ColuberMandarinu,玉斑锦蛇全长1 m左右,尾长约为全长的五分之一。背面紫灰或灰褐色,正背有一行18~31+6~11个约等距排列的黑色大菱斑,菱斑中心黄色;腹面灰白色,散有长短不一,交互排列的黑斑。头背黄色,有典型的黑色倒“V”字型套叠斑纹。眶前鳞1,眶后鳞2;颞鳞2(1)+3(2);上唇鳞7,2-2-3式,或8,3-2-3或2-2-4式;下唇鳞9,前4枚切前颔片。背鳞23-23-19行,平滑;腹鳞181~238;肛鳞二分;尾下鳞53~75对。

通过外表形态可以看出横斑锦蛇和玉斑锦蛇的头部和尾部斑纹较为相似,Schulz在1989提出横斑锦蛇是玉斑锦蛇的变异体,并且有许多人认为横斑锦蛇和玉斑锦蛇是同一个物种。可是仅从外表形态判断横斑锦蛇和玉斑锦蛇的关系是不够的,也是不足以说服他们之间的关系。在过去的20年中,分析线粒体作为一个多功能的DNA基因已被成功和有效的工具,调查的亲缘关系。蛇最常见的使用的片段是线粒体细胞色素b(细胞色素b)和/或NADH脱氢酶亚单位4(ND4基因)基因(例如克劳斯和布朗,1998年Kelly等人,2003年。Malhotra和索普,2004年,劳森等人,2005年;Burbrink和Lawson,2007)。本文拟从线粒体DNA及形态特征上对横斑锦蛇及玉斑锦蛇的关系进行研究。

12SRNA在序列中是较保守的序列。现在通过提取横斑锦蛇线粒体DNA,并对其中的3个基因12SRNA、ND4、细胞色素b进行扩增、测序,最后与玉斑锦蛇的相应的线粒体DNA片段进行比较,建立分子系统树,计算遗传距离的方法来证明横班锦蛇和玉斑锦蛇是两个不同的物种。

1 材料和方法

1.1 实验材料

供试实验材料为2010年在雅安市蜂桶寨自然保护区采集的横斑锦蛇标本的肌肉组织。玉斑锦蛇及锦蛇属其余物种的基因序列来自于NCBI(表1)。

1.2 实验方法

1.2.1 总DNA的提取

本研究中采用常规的苯酚-氯仿法提取总DNA,步骤如下:

(1)取材:取用95%乙醇保存的蛇肌肉30 mg~50 mg 于1.5 ml 的EP管中。取样是要注意清洁,避免交叉污染。将EP 管中的酒精倒干,用dd H2O清洗一遍,或将样品置于55℃的烘箱中至无酒精味即可。

表1 17个物种的GenBank 登陆号

Tab.1 17 species’s genBank numbers

(2)消化:将EP 管中加入450 μL Tris-HCl 裂解缓冲液,再加50 μL 10%SDS。最后加蛋白酶K(PK)10 μL。50℃水浴20 h 左右,至样品全部裂解至溶液澄清(期间要多次振荡)。

(3)抽提1:加等体积苯酚(约510 μL),翻转振荡10 min。12 000 r·min-1离心10 min,取上清液。

(4)抽提2:将上清液取入另一个干净的EP 管,针对上清液的量加一半的苯酚和一半的氯仿,翻转振荡8 min~10 min。12 000 r·min-1离心10 min。

(5)抽提3:取上清液于干净EP 管中,加入等体积的氯仿,可加至1 000μL,振荡8 min~10 min。12 000 r·min-1离心10 min。

(6)沉淀:取上清液于一个干净的EP 管中,加入上清液体积的10%的3 Mol/L 的NaAC。再加入总量2~2.5 倍体积的-20℃冰冻的无水乙醇。一个一个轻轻混匀。冰箱-20℃冷冻30 min(也可冷藏时间稍长或过夜)。13 000 r·min-1离心25 min,轻轻倾倒完液体(此步需要小心操作避免DNA 块被倒出)。

(7)漂洗:取70%的酒精120 μL 于EP 管内,轻旋后把酒精倒掉,斜于卫生纸上,除去剩余的乙醇。

(8)溶解:在每个样品管中加入适量的dd H2O,一般加40 μL ~50 μL溶解DNA。在离心机内轻甩一下,4℃保存备用。

(9)电泳检测:用1%的的琼脂糖凝胶电泳检测DNA,根据点样的含量和条带的亮度,估计DNA 的浓度,方便以后的实验。

1.2.2 PCR的扩增

细胞色素b的引物:L14910/H16064 (Burbrink et al.,2000)

ND4的引物:ND4/Leu(Arévalo et al.,1994)

12S的引物:L1091mod/H1557mod (Zaher et al.,2009)

反应体积为25 μL,包括配备的反应缓冲液2.5 uL,2.5 mmol·L-1的dNTP 2 μL,10 pmol ·μL-1上下游引物各0.5 μL,2.5 U·μL-1Taq聚合酶0.25 μL,总DNA 1 μL (含10 ng~100 ng DNA),dd H2O 补足到25 μL。12S扩增条件如下:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性40 s,57℃退火50 s,72 ℃延伸60 s,最后一个循环72 ℃再延伸5 min,循环次数为35 次;最后4℃保存。ND4和细胞色素b扩增条件如下:95 ℃预变性5 min;95℃变性1min,58℃退火1min,72 ℃延伸1 min 20s,循环次数为35 次;最后一个循环72 ℃再延伸5 min,最后4℃保存。

1.2.3 PCR产物的纯化

PCR产物的纯化均采用柱式PCR 产物回收试剂盒纯化。回收步骤按照试剂盒使用说明书进行。纯化后用琼脂糖凝胶电泳检测条带。

1.2.4 测序

将纯化的PCR 产物委托生物技术公司测定。

1.2.5 数据分析

DNA 序列用Bioedit 软件(Hall,1999)的Clustal W Multiple alignment进行比对,并辅以人工校正和编辑,同时拼接12S rRNA、细胞色素b和ND4。由于细胞色素b和ND4是双向测序,在拼接ND4时,要仔细核查峰图文件。同时与近缘种如玉斑锦蛇等的序列进行比对。在GenBank 下载玉斑锦蛇的同段基因序列作为参照模板进行编辑。

分别在GenBank上下载亲缘关系较近的17个物种的12S rRNA、细胞色素b和ND4序列,同时拼接12S rRNA、细胞色素b和ND4序列。

采用MEGA 4.0 软件(Tamura,Dudley,Nei,and Kumar 2006)计算核苷酸的组成、变异位点数目等序列特征,用 Kimura 2-parameter 模型,计算不同种群间的遗传距离。

采用邻接法(neighbor-joining,or NJ),分别对12S rRNA、细胞色素b、ND4以及它们的拼接序列构建分子系统发育树。NJ法计算进化树时去除序列间的成对缺失,并对进化树进行自举检验(bootstrap),重复抽样1 000次,此法在MEGA4.0中执行。

2 结果和分析

2.1 横斑锦蛇和玉斑锦蛇的外形特点比较

从横斑锦蛇和玉斑锦蛇的外形特征上比较,横斑锦蛇全长1m以上,尾长占全长的1/5左右。背鳞19~19~17行,腹鳞224~231,肛鳞二分,尾下鳞57~69对。眶前鳞1,眶后鳞2;颞鳞1+2;上唇鳞7,2-2-3式;下唇鳞8或9,前4(3)枚切前颌片。躯尾背面呈不规则的窄横纹;头背斑纹的典型特征是:前端有两条黑横纹,一横跨吻背,一横跨两眼间,在眼下伸达唇缘,眼后另有一短黑纹斜达口角;头顶部有2~3个尖端向前,彼此套迭的倒“V”字形黑纹。玉斑锦蛇全长1 m左右,尾长约为全长的1/5。背面紫灰或灰褐色,正背有一行18~31+6~11个约等距排列的黑色大菱斑,菱斑中心黄色;腹面灰白色,散有长短不一,交互排列的黑斑。头背黄色,有典型的黑色倒“V”字型套叠斑纹。眶前鳞1,眶后鳞2;颞鳞2(1)+3(2);上唇鳞7,2-2-3式,或8,3-2-3或2-2-4式;下唇鳞9,前4枚切前颔片。背鳞23-23-19行,平滑;腹鳞181~238;肛鳞二分;尾下鳞53~75对(表2)。

表2 横斑锦蛇和玉斑锦蛇的鳞被特征比较

Tab.2 Comparison ofElapheperlaceaandElaphemandarinus’ssquama

类别横斑锦蛇玉斑锦蛇背鳞19~19~17行23-23-19行腹鳞224~231181~238肛鳞二分二分尾下鳞57~69对53~75对眶前鳞11眶后鳞22颞鳞1+22(1)+3(2)上唇鳞7,2-2-3式7,2-2-3式或8,3-2-3或2-2-4式下唇鳞8或99前颔片4(3)枚前4枚

通过外形比较,横斑锦蛇和玉斑锦蛇的外部特点确实相似。虽然在任何地区理解蛇的多样性历来依靠形态分析数据,但是形态数据已被证明难以揭开神秘的多样性理解物种间的关系。最终要通过分子水平进行验证。

2.2 序列特征

12S+cytb+ND4合并后的序列:将样本的3个基因片段连接后,得到2 417 bp。其中变异位点951个,简约信息位点707个,平均转换与颠换之比R=2.014,平均T、C、A、G的百分含量分别为26.3%,27%,34.5%,12.2%,G+C含量为39.2%。

2.3 使用邻接法(NJ)构建分子系统发生树

根据所测序列,采用邻接法构建16种蛇系统发生树,所研究的16种蛇分成4个支系(图1)。第1个支系包括剑蛇属(Sibynophis)的两种蛇,自举检验置信度为100;第2个支系为雅蛇属(Rhadinophis),自举检验置信度为39;德州鼠蛇(Elapheobsolete),鲍氏蛇属(Bogertophisrosaliae),光滑蛇(Arizonaelegans)构成第3支系。自举检验置信度为45。其他几种蛇构成第4支系。第1支系剑蛇属在系统树的最基部,为16种中较原始的类群。

图1 NJ 法构建立系统发育树(N-J tree of 16 species)

2.4 遗传距离(如图3.2所示)

通过遗传距离表可以看出,横斑锦蛇(Elapheperlacea)和玉斑锦蛇(Elaphemandarinus)之间的遗传距离是0.126,其中王锦蛇(Elaphecarinatavoucher)与日本四线锦蛇(Elaphequadrivirgata)之间的遗传距离0.111,王锦蛇(Elaphecarinatavoucher)与棕黑锦蛇(Elaphecarinatavoucher)的遗传距离0.121,青大将(Elapheclimacophora)和日本四线锦蛇(Elaphequadrivirgata)的遗传距离0.114,即:王锦蛇与日本四线锦蛇遗传距离0.111<青大将和日本四线锦蛇的遗传距离0.114<王锦蛇与棕黑锦蛇的遗传距离0.121<横斑锦蛇和玉斑锦蛇之间的遗传距离是0.126。这说明横斑锦蛇确实已经达到不同物种间的最小遗传距离。

表3 16种蛇之间的遗传距离

Tab.3 Genetic distance of 16 species

4 讨论

4.1 实验技术的讨论

在采用常规的95℃循环变性扩增时,最初用了不同的梯度测试12 s的扩增效果,最后检测出来发现在51℃~58℃之间不同的温度梯度下扩增出来的效果都较好,在细胞色素b中,在95℃变性过程中可以适当延长至1 min,退火的温度也可以增加为58℃。在检测扩增产物的过程中发现,如果电泳的时间超过30 min,可能导致检测结果出现拖带的情况,这也许是引物二聚体引起的结果偏差。

4.2 横斑锦蛇与玉斑锦蛇的关系

通过NJ法建立的系统发生树中剑蛇属在系统树的最底部,表明在这16种蛇中是比较原始的。在最上层的是横斑锦蛇和玉斑锦蛇,说明这两种锦蛇在广义锦蛇属中的分化时间较晚。支持横斑锦蛇与玉斑锦蛇为姐妹群的支持率为99,说明这两个物种系统发育关系很近,拥有最近共同祖先。从遗传距离表中也可以看出,横斑锦蛇和玉斑锦蛇的遗传距离为0.126,比王锦蛇与日本四线锦蛇之间的遗传距离0.111,王锦蛇与棕黑锦蛇的遗传距离0.121,青大将和日本四线锦蛇的遗传距离0.114,都要更大,因此更加说明了横斑和玉斑的遗传距离确实也达到了种的水平。

鳞被特征常常最为爬行动物分类的最重要的鉴别特征。通过查找资料发现在形态特征上,横斑锦蛇与玉斑锦蛇主要在以下方面有较稳定的区别:横斑锦蛇的背鳞19~19~17行,腹鳞224~231,而玉斑锦蛇的背鳞23-23-19行,腹鳞181~238;横斑锦蛇的尾下鳞57~69对,而玉斑锦蛇的尾下鳞53~75对;横斑锦蛇的上唇鳞7,2-2-3式,下唇鳞8或9,而玉斑锦蛇的上唇鳞7,2-2-3式,或8,3-2-3或2-2-4式,下唇鳞是9。这些鳞被之间的稳定性差异说明了横斑锦蛇和玉斑锦蛇是不同的物种。这与赵尔宓(2003)的结果一致。支持横斑锦蛇为一有效物种。

4.3 横斑锦蛇的保护

总的来说,横斑锦蛇的分布十分狭窄,数量也相当稀少。据四川省陆生野生动物调查估计数量不足一万只。同时,横斑锦蛇的分布是不均衡的,在某些局部区域数量相对较丰富。例如,在原分布区的汶川卧龙保护区和雅安,某次四川省陆生野生动物调查中未能见到; 而在石棉县的田湾河区域,密度为194 只·km-1。对于横斑锦蛇现今的数量并不乐观,因此希望在相应的分布区里面加强保护。建议通过以下一些措施加强对横斑锦蛇的保护(胡锦矗,胡杰,李艳红,2002 21( 3))。

(1)加强科学研究:虽然横斑锦蛇已被列为四川省重点保护野生动物,但我们对于这一物种的了解尚很缺乏,有关其保护生物学方面的研究也有待于深入。通过调查,可选择数量相对较丰富的石棉县田湾河区域,对其个体生物学、生态学等开展专题研究。

(2)加强宣传、严格执法:过去在横斑锦蛇产区的一些收购站中,曾有报道收购到本种蛇的标本。现在,虽然收购站已被取缔,但非法收购、捕捉的现象却时有发生。因此,在有横斑锦蛇分布的县、市,各级林业主管部门及基层单位一方面要加强对公众的保护宣传,另一方面对于非法捕捉、收售该种蛇类的不法分子要严厉打击(胡杰,李艳红等,2002)

现今对于横斑锦蛇的研究也比较欠缺,NCBI上还没有收录关于横斑锦蛇的任何基因序列,这对于横斑锦蛇的保护是不利的。因此希望能通过各方面的关注,提高大家对横斑锦蛇的保护意识。

[1] Klaus-Dieter Schulz.游蛇科锦蛇属专著[J].四川动物,1996.

[2] LING Chen,LIU Shao ying,HUANG Song,et al.Phylogenetic Analyses Reveal a Unique Species ofElaphe(Serpentes,Colubridae) New to Science [J].Asian Herpetological Research,2010-1-2.

[3] Song HUANG,Li DING,Frank T,et al.A New Species of the GenusElaphe(Squamata:Colubridae) from Zoige County,Sichuan,China[J].Asian Herpetological Research,2012-3.

[4] 邓其祥,江耀明.中国的横斑锦蛇[J].四川师范学院学报,1989;10(2).

[5] 胡杰,李艳红,李操,等.横斑锦蛇的现状[J].四川动物,2002-04-09.

[6] 莫邦辉,袁水全,郑渝池,等.一种改进的齿突蟾动物肌肉线粒体DNA提取方法[J].应用与环境生物学报,2004-10.

[7] 孟哲.中国专家发现蛇类新种,西部或为锦蛇属发源地[N].新华网,2012-4-15.

[8] 童宗中,王义权,周开亚.从12SrRNA 基因片段序列研究20 种蛇的系统发生关系[J].动物学报,2002,48(4).

[9] 王义权,周开亚.几种游蛇的Cytb基因片段序列分析及其演化关系[J].动物学报.1999-3.

[10] 蒋艾洺.蜂桶寨保护区发现省级重点保护野生动物横斑锦蛇[N].四川新闻网,2010-7-15.

[11] 赵尔宓编.四川爬行类原色图鉴[M].中国林业出版社.

Relationships BetweenElapheperlaceaandElaphemandarinusBased on Morphological Characters and Mitochondrial 12S, Cyt b and ND4 Gene Sequences

AN Xiao-yan1,2HUANG Yan2*DING Li3GAN Shao-xiong1MAO Xiao-tao4LI Shu-bin4

(1.Sichuan Academy of Forestry,Chengdu 610081,China; 2.Institute of Rare Animals and Plants,West China Normal University,Nanchong 637009,China; 3.Chengdu Institute of Biology,Chinese Academy of Sciences,Chengdu 610041,China; 4.Tianquan County Forestry Bureau,Ya’an 625500,China)

Elapheperlaceabelongs toElaphe,Megapodiidae.Stejneger collected a male specimen in Ya’an and named itElapheperlaceain 1929.The number ofElapheperlaceais rare,and its distribution areas are limited.Elapheperlaceais the least studied species ofElaphe.Elaphemandarinusalso belongs toElaphe,and it was named in 1882.Due to the similarities in heads and tails of both species and the limited information,it is difficult to differentiate the two species.In 2010,a specimen ofElapheperlaceawas collected in Fengtongzhai Nature Reserve of Ya’an.We obtained DNA sequence data ofElapheperlacea(complete sequences of the mitochondrial NADH dehydrogenase subunit 4 [ND4] gene,cytochrome b gene and 12S rRNA partial sequences) and established phylogeny trees to examine the relationship ofElaphespecies.The phylogenetic tree showed thatElapheperlaceaandElaphemandarinuswere sister species,but also two valid species.And we also examined the morphological characters ofElapheperlaceaandElaphemandarinus,and found that there were stable differences between them.

Elapheperlacea,Mitochondrial DNA,Elaphemandarinus,phylogeny relationship; morphological characters

2016-12-13

天全县润楠、香果树和横斑锦蛇极小种群拯救保护项目调查监测、生境营造及技术培训部分(项目编号:天政采招[2014] 26号)。

安小燕(1987-),女,四川宜宾,中学二级教师。

*通讯作者:黄燕(1982-),女,博士,讲师,主要研究方向:动物学。

10.16779/j.cnki.1003-5508.2017.02.015

Q959.3

A

1003-5508(2017)02-0085-06

猜你喜欢
遗传物种距离
吃光入侵物种真的是解决之道吗?
英语世界(2023年10期)2023-11-17 09:18:18
非遗传承
区域治理(2022年40期)2022-11-27 04:01:54
还有什么会遗传?
还有什么会遗传
还有什么会遗传?
回首2018,这些新物种值得关注
算距离
电咖再造新物种
汽车观察(2018年10期)2018-11-06 07:05:26
每次失败都会距离成功更近一步
山东青年(2016年3期)2016-02-28 14:25:55
疯狂的外来入侵物种