锌指蛋白703在甲状腺乳头状癌中的表达及意义

李丁，刘阁玲，杨晓琳

(华北理工大学附属唐山市工人医院内分泌一科，河北唐山063000)

锌指蛋白703在甲状腺乳头状癌中的表达及意义

李丁，刘阁玲，杨晓琳

(华北理工大学附属唐山市工人医院内分泌一科，河北唐山063000)

目的研究锌指蛋白703(ZNF703)在甲状腺乳头状癌中的表达(包括阳性率及相对表达量)及阳性率与临床特征的关系。方法应用免疫组织化学法(pv9000法)检测组织芯片(包括36例甲状腺乳头状癌及14例癌旁正常组织)中ZNF703的阳性表达率，并分析癌组织中的阳性表达率与芯片包含的相关临床资料(年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期)之间的关系。另收集20例临床新鲜甲状腺乳头状癌及匹配癌旁组织样本，应用Western blot及RT-PCR技术检测ZNF703在20对组织样本的蛋白和mRNA相对表达量。结果免疫组化提示ZNF703在甲状腺乳头状癌的阳性表达率为66.7%，较癌旁组织的21.4%明显增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；癌组织阳性表达率与年龄、性别无关，与肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移有关(P＜0.05)。Western blot及RT-PCR提示ZNF703在20例甲状腺乳头状癌组织的蛋白相对表达量[(0.893±0.113)vs(0.510±0.072)]及mRNA相对表达量[(6.399± 2.096)vs(1.285±0.354)]均高于匹配癌旁组织，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论ZNF703在甲状腺乳头状癌中的表达高于癌旁组织，并且在癌组织中ZNF703阳性率高低与患者临床分期、淋巴结转移及肿瘤大小有关，可见ZNF703在甲状腺乳头状癌的发生及进展中可能发挥促进作用。

甲状腺乳头状癌；锌指蛋白703；癌旁组织

近年来我国甲状腺癌的发病率不断上升[1]，其中甲状腺乳头状癌是最常见的亚型，在沿海及高碘地区，其发病比例已达90%以上[2]。人类锌指蛋白广泛表达于真核生物中，作为转录抑制因子，调节细胞的分化、增殖和凋亡等过程[3-4]，ZNF703(锌指蛋白703)为锌指蛋白家族成员，基因定位于染色体8区域(8p11.23)[5]，是新发现的乳腺癌致癌因子，伴随表达量升高，患者预后变差[6]。随后国内外研究中相继发现了ZNF703在人类子宫内膜癌、大肠癌、胃癌、头颈部鳞癌中均有较高表达，发挥致癌作用[7-10]。目前ZNF703在甲状腺癌中的表达情况国内外无相关报道，本文拟通过检测ZNF703在甲状腺乳头状癌及癌旁组织中的表达情况，并分析其与临床预后的相关性，进一步研究ZNF703在甲状腺乳头状癌发生发展中的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源组织芯片(TH242、TH808)购买于美国US Biomax公司，其中甲状腺乳头状癌36例，甲状腺癌旁正常组织14例。芯片包含相关临床资料。乳头状癌组患者男性6例，女性30例；年龄≥45岁者15例，＜45岁者21例；肿瘤直径≤4 cm者21例，直径＞4 cm者15例；淋巴结转移者8例，淋巴结未转移者28例；依据AJCC癌症分期手册第七版标准：临床分期Ⅰ～Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ期9例。20例甲状腺乳头状癌及癌旁组织标本均取材于唐山开滦总医院2016年3～10月期间手术切除的肿瘤，癌旁组织取材处距离癌组织边缘≥3 cm，患者均为初次手术，术前无放疗、化疗及其他免疫治疗。组织样本均在离体后半小时内放于液氮中速冻，后转移至-80℃冰箱长期保存，取材组织均经过术中冰冻病理检测，确认为甲状腺乳头状癌及癌旁正常组织。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂兔抗人单克隆抗体ZNF703 (ab188031)、兔抗人多克隆抗体ZNF703(ab137054)均购自美国abcam公司，兔抗人多克隆抗体B-actin购自中国华安生物公司，通用型抗体PV9000试剂盒(两步法)购自北京中衫金桥生物有限公司。Trizol、cDNA逆转录试剂盒、SYBRTMGreen定量试剂盒均购于Invitrogen公司。ECL超敏发光检测试剂盒购自美国novex公司。

1.2.2 免疫组化染色及结果判定采用乳腺癌石蜡切片作为阳性对照，PBS缓冲液代替一抗进行阴性对照。将待测芯片脱蜡水化、抗原修复、内源性封闭，一抗抗体ZNF703(ab188031)稀释度1:50滴加组织，4℃孵育过夜，通用型二抗PV9000及DAB显色试剂盒均按照说明书严格操作。ZNF703蛋白的染色表达主要位于细胞核，阳性呈棕黄色。以阳性细胞率评分和染色强度评分为判定标准：染色细胞≤10%为0分；染色细胞在11%～30%为1分；染色细胞在31%～50%为2分；染色细胞在50%以上为3分；细胞核染色强度无染色计0分，染浅黄色计1分，棕黄色计2分，深棕色计3分，两项分数相加后≤1分为阴性，其余视为阳性表达。

1.2.3 实时荧光定量PCR操作步骤及检测方法称取储存于-80℃冰箱的癌及癌旁组织各80 mg，采用TRizol法提取RNA，严格按逆转录试剂盒说明书要求合成cDNA，扩增总反应体系为20 μL，其中cDNA(1 000 ng/μL)模板加入2 U，左右引物各1 U，SYBRTMGreen扩增Mix 10 U，无酶水6 U，反应条件为95℃2 min预变性，45个循环：变性95℃15 s，退火及延伸60℃30 s，以GAPDH基因作为内参。设置癌组织为试验组，癌旁组织为对照组，随机抽取一例对照组样品为代表1倍目基因表达量的校正样品，以2-△△CT法计算其他样品相对表达量。引物：ZNF703(F 5'-AACGGCCCACATGAGTCAAT-3'R5'-GGCGGGGA TCATGTCGTTAT-3')，GAPDH(F5'-GAAAGCCTGCCG GTGACTAA-3'R5'-AGGAAAAGCATCACCCGGAG)。

1.2.4 Western blot操作步骤及检测方法称量-80℃冰箱的癌及癌旁组织各60 mg，1 mL裂解液+ 4 μL PSMF充分裂解组织，离心，取上清，BCA蛋白定量试剂盒测蛋白浓度，统一每孔上样量为30 μg进行SDS-PAGE，稳流低温电转至硝酸纤维素膜条带上，5%脱脂牛奶封闭条带1 h，加入一抗(ZNF703 (ab137054)1:2 000稀释，抗体B-actin1:1 000稀释)4℃孵育过夜，加入二抗兔抗人荧光标记抗体，37℃孵育30 min，加入ECL发光剂显影，以Image J软件计算条带的灰度值，蛋白相对表达量用ZNF703与GAPDH条带的灰度比值表示。

1.3 统计学方法应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计数资料以四格表表示，其中阳性表达率结果采用χ2检验，癌组织阳性表达率与临床特征关系采用Fisher确切概率法。计量资料以均数±标准差()表示，两组间比较采用配对样本t检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学染色结果图1的染色结果显示，ZNF703主要在胞核内表达。ZNF703在36例甲状腺乳头状癌组织中24例阳性表达，表达率为66.7%，在14例甲状腺正常组织中3例阳性表达，表达率为21.4%，见表1。

图1 免疫组织化学检测ZNF703在甲状腺乳头状癌及癌旁组织的表达(200×)

表1 ZNF703在甲状腺乳头状癌及癌旁组织中的表达率（例）

2.2 ZNF703的阳性表达率与临床病理特征的相关性ZNF703在甲状腺乳头状癌中的阳性表达率与患者的年龄、性别无显著相关性，与患者的肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期相关(P＜0.05)，见表2。

表2 ZNF703阳性表达率与甲状腺乳头状癌临床特征的关系(例)

2.3 实时荧光定量PCR及Western blot检测结果RT-PCR检测结果(图2)和Western blot检测结果(图3)显示，ZNF703在20例甲状腺乳头状癌中的mRNA相对表达量和蛋白相对表达量均高于匹配癌旁组织，差异均具有显著统计学意义(P＜0.05)，见表3。

图2 RT-PCR检测ZNF703在甲状腺乳头状癌及癌旁组织的相对表达量

图3 Western blotting检测ZNF703在甲状腺乳头状癌组织及癌旁组织中的相对表达量

表3 ZN03在20例癌组织及癌旁组织中蛋白及mRNA相对表达量()

表3 ZN03在20例癌组织及癌旁组织中蛋白及mRNA相对表达量()

组别甲状腺乳头状癌匹配癌旁组织t值P值蛋白相对表达量0.893±0.113 0.510±0.072 21.519 0.000 mRNA相对表达量6.399±2.096 1.285±0.354 12.214 0.000

3 讨论

Lin等[11]发现雌激素反应元件ERB(Erb B2)和细胞周期蛋白D1(CCND1)作用于ZNF703启动子区域，表明ZNF703可能受到雌激素与CCND1下游调节，然而CCND1和雌激素与人体甲状腺癌发生高度相关，均发挥促进癌变作用[12-13]，这提示ZNF703很可能参与了甲状腺癌发生的分子通路中。本研究检测了ZNF703在甲状腺乳头状癌及癌旁组织中的表达情况，发现ZNF703在乳头状癌中的表达明显高于癌旁组织，且与肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期相关，这与ZNF703在乳腺癌、大肠癌、胃癌等研究的结果是一致的。ZNF703在人体多器官中发挥癌基因的作用，提示我们ZNF703可能参与经典致癌通路。

ZNF703的致癌作用可能与其参与细胞周期调控有关，Sircoulomb等[14]发现ZNF703过度表达促使乳腺癌MCF7细胞中RB1磷酸化，下调P27kip1蛋白，上调E2F1(细胞周期相关转录因子)和CCNE1(G1/S特异性细胞周期蛋白E1)的表达，诱发细胞从G1期跳脱R点的限制作用而进入S期，促进细胞恶性增殖而致癌。此外，ZNF703可以抑制TGFβ受体Ⅱ的活性及E钙粘蛋白的表达，上调亲迁徙性P120连环亚蛋白表达，促进细胞的增殖及迁移，使癌细胞更具有侵袭性[14]，这也解释了ZNF703在乳腺癌、胃癌中随着表达的升高，肿瘤直径增大，淋巴结转移情况更多见。另外Holland等[15]发现ZNF703刺激小鼠胚胎成纤维细胞转化为成纤维细胞，而成纤维细胞是一个典型的促癌因子，在人类管腔乳腺癌细胞系中有规律的扩增，增强乳腺癌管腔细胞转化为干细胞的频率，这也提示ZNF703可能参与了癌细胞的分化调控，具体机制有待研究。

综上所述，ZNF703在甲状腺乳头状癌中的表达明显高于癌旁组织，且相关临床预后，所以可能充当致癌因子角色。ZNF703受到雌激素调节，参与调节细胞生长周期，因此通过对ZNF703作用机制的深入探索，有望为甲状腺乳头状癌的激素和分子靶向治疗提供一定的实验依据。

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Expression of zinc finger protein 703 in papillary thyroid carcinoma and its significance.

LI Ding,LIU Ge-ling, YANG Xiao-lin.First Department of Endocrinology,Tangshan Municipal People's Hospital Affiliated to North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,Hebei,CHINA

ObjectiveTo study the expressions(including the positive rate and the relative expression)of zinc finger protein 703(ZNF703)in papillary thyroid carcinoma and the relationship between the positive rate and the related clinical characteristics.MethodsImmunohistochemistry PV-9000 method was used to detect the positive expression rate of ZNF703 in tissue chips(including 36 cases of papillary thyroid carcinomas,14 cases of para-carcinoma tissues), and the relationship between the positive expression rates of ZNF703 in papillary thyroid carcinomas and clinical characteristics included by the chip(including age,gender,tumor size,lymph node metastasis,clinical stage)was analyzed.In addition,20 cases of clinical fresh papillary thyroid carcinomas and para-carcinoma tissues were collected.Western blot and RT-PCR were used to detect the relative expressions of protein and mRNA of ZNF703 in 20 pairs of cases papillary thyroid carcinomas and para-carcinoma tissues.ResultsImmunohistochemistry study showed that the positive expression rate of ZNF703 in papillary thyroid carcinoma(66.7%)was significantly higher than that in para-carcinoma tissues (21.4%)(P＜0.05).The positive rate of papillary thyroid carcinomas was correlated with tumor size,lymph node metastasis,clinical stage(P＜0.05),and was not related to age,gender.Western-blot and RT-PCR indicated that the relative expression of protein and mRNA of ZNF703 in 20 cases of papillary thyroid carcinomas were respectively(0.893±0.113) and(6.399±2.096),which were significantly higher than(0.510±0.072)and(1.285±0.354)in matched para-carcinoma tissues(P＜0.05).ConclusionThe expression of ZNF703 in papillary thyroid carcinoma is higher than that in para-carcinoma tissue,and the positive rate of ZNF703 in cancer tissues is correlated with clinical stage,lymph node metastasis and tumor size.So ZNF703 may play a carcinogenic role in the occurrence and development of papillary thyroid cancer.

Thyroid papillary carcinoma;Zinc finger protein 703(ZNF703);Para-carcinoma tissues

R736.1

A

1003—6350（2017）07—1104—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.07.026

2016-11-06)

李丁。E-mail：870745784@qq.com