次黄嘌呤核苷酸脱氢酶对猪链球菌2型ZY05719基因转录谱的影响

周俊明++何孔旺++倪艳秀++祝昊丹+俞正玉+茅爱华++吕立新

摘要：次黄嘌呤核苷酸脱氢酶（IMPDH）是猪链球菌2型的毒力相关因子，该基因的丢失降低了猪链球菌2型菌株ZY05719黏附HEp-2、PK15细胞的能力。为全面掌握IMPDH对ZY05719致病力的影响机制，采用定制的Agilent猪链球菌2型基因表达谱芯片，比较了亲本菌株ZY05719（ZY）和impdh敲除菌株（ΔZY）的基因转录情况。结果显示，impdh的丢失影响了254个基因的转录，其中包括impdh的下调基因177个，上调基因77个。对差异基因进行同类群聚类（Clusters of Orthologous Groups，COG）分析，显示差异基因主要集中于氨基酸、碳水化合物的转运代谢，以及核糖体、细胞壁、细胞膜的生物合成和防御机制。本研究较为全面地分析了impdh对猪链球菌2型基因转录谱的影响，为解释impdh在猪链球菌致病中发挥的作用提供了数据支持。

关键词：猪链球菌2型；表达谱芯片；同类群聚类；次黄嘌呤核苷酸脱氮酶；基因转录谱

中图分类号： S858.285.1+1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）06-0027-03

猪链球菌（Streptococcus suis）是有荚膜的革兰氏阳性球菌，是世界范围内流行的一种重要的猪病原菌[1]，该菌往往引起保育猪或断奶仔猪发生脑膜炎、败血症、关节炎[2]。依据荚膜多糖抗原可将S. suis分为33个血清型（包括1～31、33、1/2型）[3]，其中S. suis 2致病力最强、流行范围最广，并且能够引起人发生脑膜炎和严重的毒性休克综合征[4-6]。1998、2005年分别在我国江苏省、四川省部分地区暴发了人感染猪链球菌病，病原菌即为猪链球菌2型[7]。S. suis已成为越南南部地区成人细菌性脑膜炎的主要病因[8]，人可通过与发病猪的直接接触感染S. suis，而人与人之间的传播目前尚未得到证实。对S. suis 2的研究陆续发现了荚膜、溶血素、纤连蛋白结合蛋白、血清浑浊因子等毒力相关因子[9]。笔者所在研究室的前期工作中，对SS2-H、ZY05719菌株的impdh基因进行敲除，发现与亲本株相比，缺失株对猪的致病力均有所下降，提出IMPDH为S. suis 2的毒力相关因子[10-11]，但IMPDH对S. suis 2致病力的影响还缺少系统性认识。本研究采用猪链球菌2型的表达谱芯片，比较了亲本菌株ZY05719（ZY）和impdh敲除菌株（ΔZY）的基因转录谱，并对差异基因进行了归类分析。

1材料与方法

1.1细菌培养

本研究涉及2株猪链球菌2型菌株，包括强毒菌株ZY、ΔZY。ZY为2005年分离自四川省资阳市发生猪链球菌病的猪组织（由南京农业大学动物医学院微生物组惠赠）；ΔZY为敲除impdh的ZY菌株，由笔者所在研究室构建获得。

细菌在THB（Todd-Heitt broth，BD）平板上进行培养，无菌挑取菌落进入THB液体培养基中，于37 ℃下培养过夜。将此培养物按照1%的接种比例接入新的THB液体培养基中，于37 ℃下培养至细菌对数生长期，革兰氏染色观察细菌形态。

1.2RNA提取和纯化

采用TRIzol Reagent（Life technologies，US）并根据生产厂商提供的标准操作流程进行样品的细菌总RNA抽提。采用Biomate 3S型超微量紫外可见分光光度计（Thermo，US）测定抽提所得总RNA样品的浓度及D260 nm/D280 nm比值，另外经Agilent Bioanalyzer 2100型电泳（Agilent technologies，US）质检合格后使用RNeasy mini kit（Qiagen，Germany）和RNase-Free DNase Set（Qiagen，Germany），纯化总RNA。

1.3样品RNA的放大和标记

采用Agilent表达谱芯片配套试剂盒、Low RNA Input Linear Amplification kit（Agilent technologies，US）、5-（3-aminoallyl）-UTP（Ambion，US）、Cy3 NHS ester（GE healthcare Biosciences，US），按照标准操作流程对样品总RNA中的mRNA进行放大和标记，并用RNeasy mini kit（QIAGEN，Germany）纯化标记后的cRNA。

1.4芯片杂交

依据SS2-05ZYH33菌株基因序列，定制Agilent公司的8×15 kbp表达谱芯片，该芯片包含2 178个探针（每个探针含60个碱基）。按照Agilent表达谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒，采用Gene Expression Hybridization Kit（Agilent technologies，US），在Hybridization Oven型滚动杂交炉（Agilent technologies，US）中以65 ℃、10 r/min滾动杂交 17 h，杂交cRNA上样量为1.65 μg，并在staining dishes型洗缸（Thermo Shandon，US）中洗片，洗片所用试剂为Gene Expression Wash Buffer Kit（Agilent technologies，US）、Stabilization and Drying Solution（Agilent technologies，US）。

1.5结果扫描

完成杂交的芯片采用Agilent Microarray Scanner（Agilent technologies，US）进行扫描，用Feature Extraction software 10.7软件（Agilent technologies，US）读取数据，最后采用Gene Spring Software 11.0软件（Agilent technologies，US）对数据进行Quantile算法的归一化处理。每个菌株设3个重复，比较亲本株与缺失株之间差异2倍以上且具有统计学意义（P<0.05）的基因。以上内容均由上海伯豪生物技术有限公司完成。

1.6差異基因的同类群聚类（COG）

参照文献[12]中的方法，将上述筛选的差异基因进行同源群聚类（clusters of orthologous groups，COG）分析。

1.7数据统计方法

对ZY、ΔZY 2组样品的3个重复分别采用随机方差 t-检验，测算2组样品间每个转录本差异表达的显著性强度，差异基因P<0.05有统计学意义。

2结果与分析

2.1细菌形态

ZY与ΔZY经过革兰氏染色，通过显微镜观察1 000倍放大下的形态，可见蓝紫色球菌排列成链状的细菌，ΔZY成链稍长于ZY（图1）。

2.2RNA的质量检测

提取生长对数期细菌的RNA，测定D260 nm、D280 nm，依据D260 nm×稀释倍数×40 μg/mL计算RNA的浓度以及 D260 nm/D280 nm 比值。每个RNA样品电泳后可见3条条带，由大到小依次为23S、16S、5S，依据条带灰度值计算23S/16S比值。D260 nm/D280 nm≥1.8、23S/16S>0.7为合格RNA样本，结果见表1、图2。

2.3ZY和ΔZY表达谱芯片的比较

利用定制的Agilent表达谱芯片比较ZY和ΔZY基因的转录情况。结果表明，有254个基因的转录发生2倍以上显

著水平（P<0.05）的变化，ΔZY菌株中177个基因下调，其中impdh转录下调了99.97%以上，另外ΔZY中上调基因有77个。对这些差异基因进行COG归类，发现impdh的丢失引起了ZY菌株多数基因的转录下调，主要集中于氨基酸、碳水化合物的转运代谢，以及核糖体、细胞壁、细胞膜的生物合成和防御机制，结果见表2。

3结论与讨论

溶菌酶释放蛋白（MRP）和胞外因子（EF）早前被作为 S. suis 2的毒力标记物[13]，后续研究发现，敲除这些因子的S. suis 2后仍对仔猪具有致病力[14-15]。目前尚未明确 S. suis 2关键的毒力标记物，从而限制了对S. suis 2致病机制的认识，同时也阻碍了该病的防控技术研究，因此对S. suis 2毒力因子的进一步研究非常重要。IMPDH已被证实为 S. suis 2一类重要的毒力相关因子，本研究通过定制S. suis 2表达谱芯片，比较了亲本株ZY和impdh缺失株ΔZY之间转录本的差异。结果表明，ΔZY下调基因中直接关系到核糖体蛋白大、小亚基合成的相关基因有18个，占表达谱芯片此类基因总数的32%以上；而ΔZY上调基因中没有关系到核糖体蛋白大、小亚基合成的基因。核糖体是蛋白质合成的机器，由蛋白质和RNA组成，提示impdh基因的丢失下调部分核糖体蛋白质编码基因的转录，可能干扰了核糖体的正常合成，影响细菌蛋白质的正常合成，前期试验表明猪链球菌2型菌株GN061215中也有类似发现[16]。

荚膜为S. suis 2细胞壁外的结构，能够增强细菌抵抗吞噬细胞吞噬的能力，是目前较为公认的毒力因子[17-18]。荚膜组成包括半乳糖、葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、唾液酸，表达谱芯片中包含了荚膜合成基因（cps2A、B、C、E、D、F、H、I、J）和唾液酸合成基因。结果显示，与ZY相比，ΔZY中cps2F、H、I均出现67%以上的显著下调，提示impdh的丢失可能影响ΔZY荚膜的合成。ΔZY防御机制的相关基因中有6个下调，包括ABC多药转运系统、 β-内酰胺酶。ABC系统能够摄取营养、信号分子，并能提供细菌产生耐药性，与细菌毒力密切相关[19]；β-内酰胺酶能够水解一些药物β-内酰胺环而使药物失活，这是病原菌常见的β-内酰胺类抗生素（青霉素类、头孢菌素类）耐药的主要方式[20]，提示ZY可能比ΔZY更容易产生针对此类药物的耐受力。

ZY菌株丢失impdh基因后，引起较多基因的转录下调，且其中部分基因与细菌的致病力存在联系，较全面地解释了ΔZY毒力下降的现象。

致谢：感谢华中农业大学金梅林教授提供猪链球菌2型SS2-05ZYH33基因表达谱芯片探针序列。

参考文献：

[1]Gottschalk M. Streptococcocis[M]//Straw B E，Zimmerman J J，DAllaire S，et al. Diseases of swine. Ames，IA，USA：Blackwell Publishing，2012：841-855.

[2]Wertheim H F，Nghia H D，Taylor W A. Streptococcus suis：an emerging human pathogen[J]. Clinical Infectious Diseases，2009，48（5）：617-625.

[3]Hill J E，Gottschalk M，Brousseau R，et al. Biochemical analysis，cpn60 and 16S rDNA sequence data indicate that Streptococcus suis serotypes 32 and 34，isolated from pigs，are Streptococcus orisratti[J]. Veterinary Microbiology，2005，107（1/2）：63-69.

[4]Wei Z G，Li R，Zhang A D，et al. Characterization of Streptococcus suis isolates from the diseased pigs in China between 2003 and 2007[J]. Veterinary Microbiology，2009，137（1/2）：196-201.

[5]Kim D，Han K，Oh Y，et al. Distribution of capsular serotypes and virulence markers of Streptococcus suis isolated from pigs with polyserositis in Korea[J]. Canadian Journal of Veterinary Research-Revue Canadienne de Recherche Veterinaire，2010，74（4）：314-316.

[6]Gottschalk M，Lacouture S，Bonifait L，et al. Characterization of Streptococcus suis isolates recovered between 2008 and 2011 from diseased pigs in Quebec，Canada[J]. Veterinary Microbiology，2013，162（2/3/4）：819-825.

[7]Yu H J，Jing H Q，Chen Z H，et al. Human Streptococcus suis outbreak，Sichuan，China[J]. Emerging Infectious Diseases，2006，12（6）：914-920.

[8]Mai N T，Hoa N T，Nga T V，et al. Streptococcus suis meningitis in adults in Vietnam[J]. Clinical Infectious Diseases，2008，46（5）：659-667.

[9]Feng Y J，Zhang H M，Wu Z W，et al. Streptococcus suis infection an emerging/reemerging challenge of bacterial infectious diseases？[J]. Virulence，2014，5（4）：477-497.

[10]Zhang X H，He K W，Duan Z T，et al. Identification and characterization of inosine 5-monophosphate dehydrogenase in Streptococcus suis type 2[J]. Microbial Pathogenesis，2009，47（5）：267-273.

[11]Zhou J M，Zhang X E，He K W，et al. Characterization and proteome analysis of inosine 5-monophosphate dehydrogenase in epidemic streptococcus suis serotype 2[J]. Current Microbiology，2014，68（5）：663-669.

[12]Willenborg J，Fulde M，de Greeff A，et al. Role of glucose and CcpA in capsule expression and virulence of Streptococcus suis[J]. Microbiology，2011，157（6）：1823-1833.

[13]Vecht U，Wisselink H J，Jellema M L，et al. Identification of two proteins associated with virulence of Streptococcus suis type 2[J]. Infection and Immunity，1991，59（9）：3156-3162.

[14]Berthelot-Herault F，Gottschalk M，Morvan H，et al. Dilemma of virulence of Streptococcus suis：Canadian isolate 89-1591 characterized as a virulent strain using a standardized experimental model in pigs[J]. Canadian Journal of Veterinary Research-Revue Canadienne de Recherche Veterinaire，2005，69（3）：236-240.

[15]Smith H E，Vecht U，Wisselink H J，et al. Mutants of Streptococcus suis types 1 and 2 impaired in expression of muramidase-released protein and extracellular protein induce disease in newborn germfree pigs[J]. Infection and Immunity，1996，64（10）：4409-4412.

[16]周俊明，何孔旺，倪艷秀，等. 次黄嘌呤核苷酸脱氢酶对猪链球菌2型GN061215生物学特性及蛋白质表达的影响[J]. 江苏农业学报，2013，29（1）：114-120.

[17]Charland N，Harel J，Kobisch M，et al. Streptococcus suis serotype 2 mutants deficient in capsular expression[J]. Microbiology，1998，144（Pt2）：325-332.

[18]Smith H E，Damman M，van der Velde J，et al. Identification and characterization of the cps locus of Streptococcus suis serotype 2：the capsule protects against phagocytosis and is an important virulence factor[J]. Infection and Immunity，1999，67（4）：1750-1756.

[19]Davidson A L，Chen J. ATP-binding cassette transporters in bacteria[J]. Annual Review of Biochemistry，2004，73：241-268.

[20]Fernandez-Rojas M A，Vaca S，Reyes-Lopez M A，et al. Outer membrane vesicles of Pasteurella multocida contain virulence factors[J]. MicrobiologyOpen，2014，3（5）：711-717.唐伟，朱治任，汪财生，等. 基于COⅠ基因的DNA条形码在鳖科动物鉴定上的应用[J]. 江苏农业科学，2017，45（6）：30-36.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.006