LED激发光源的荧光物质快速检测系统设计*

郭立泉, 尹焕才,2, 田晶晶,2

(1.中国科学院 苏州生物医学工程技术研究所，江苏 苏州 215163；2.中国科学院 生物医学检验技术重点实验室，江苏 苏州 215163)

LED激发光源的荧光物质快速检测系统设计*

郭立泉1, 尹焕才1,2, 田晶晶1,2

(1.中国科学院 苏州生物医学工程技术研究所，江苏 苏州 215163；2.中国科学院 生物医学检验技术重点实验室，江苏 苏州 215163)

针对食品和生化检测中常见的荧光物质4—甲基伞形酮(4-MU)的检测问题，提出了一种基于荧光分析法的荧光物质快速检测方法，并以LED作为激发光源，设计了便携式高灵敏度的荧光物质快速检测系统，并给出电路实现。对系统与多功能酶标仪进行了对比标定和测试，结果表明：所设计的系统线性度为0.997，检测误差小于1.5 %，响应时间小于0.5 s，这对于食品和生化荧光物质检测设备的开发，具有一定的参考意义。

4-甲基伞形酮； 荧光； 荧光物质； 快速检测

0 引 言

4-甲基伞形酮(4-MU)作为一种常见的荧光指示剂，激发波长为365 nm，发射波长450 nm，具有良好的稳定性[1，2]。4-MU具有多种衍生物，包括糖苷类、酯(脂)类、肽类等，常作为荧光底物被用于病原微生物、生化指标的检测。其原理是,样本中特异性酶可以酶解荧光底物，释放出荧光基团(4-MU)，进而通过紫外灯照射显色，或通过仪器采集分析产生的荧光信号，用于相应酶的含量及酶活力的测定，从而实现某些基因缺陷性疾病或食源性致病菌含量的检测[3～6]。

相对于传统显色研究方法，荧光法灵敏性高、特异性好，具有更低的检测限, 检测灵敏度达fmol级。因此，近几年应用该方法的研究报告也日益丰富。在4-MU检测时大多使用荧光光谱仪、多功能酶标仪等大型实验室类仪器设备。对于小样本检测和现场检测而言，其价格相对昂贵，仪器维护成本较高，并且不方便移动。因此，小型化便携式的检测系统对于解决上诉问题提供了一种有效途径。

针对4-MU的检测问题，本文设计了一种基于LED激发光源调制和解调的便携式荧光信号采集系统，实现了对荧光产物的低噪声、高灵敏度和快速检测。

1 基于LED激发光源的荧光物质检测基本原理

对4-MU进行定向的修饰，可得到各种衍生物。目前，香豆素类荧光底物包括糖苷类、磷酸酯类、羧酸酯类、硫酸酯类、肽类等。这些底物中，糖苷类荧光底物(MUG)的研究和应用最为广泛,MUG在糖苷酶的作用下发生水解，生成荧光产物4-MU[7]。

以超高亮LED作为激发光源，照射在4-MU上，激发产生荧光，激发光和荧光的光谱图如图1所示。可以看出，4-MU的最佳激发波长范围为320～380 nm，荧光中心波长为450 nm。因此，选择中心波长为365 nm的LED，辅以中心波长365 nm带宽为40 nm的滤光片作为激发光源。荧光检测端由中心波长为450 nm带宽为20 nm的窄带滤光片进行滤波后，接收荧光信号，二者没有波长重叠，可实现对4-MU的检测。

图1 4-MU的LED激发光与发射光光谱

2 基于LED激发光源的荧光物质快速检测系统设计

2.1 系统总体结构框图

基于LED激发光源的荧光物质快速检测系统的总体结构如图2所示。主要包括主控制器和信号采集模块、LED光源调制与恒流驱动模块、光学系统模块、荧光和参考光检测模块等几个部分。

图2 基于LED激发光源的荧光物质快速检测系统总体框图

主控制器和信号采集与处理部分采用STM32F373进行设计，STM32F373集成16位高精度的A/D和16位的PWM以及其他丰富的外设资源，非常适合用于LED激发光源与荧光检测系统的设计。

STM32F373的PWM发出100 kHz的方波信号，通过高速模拟开关，对LED压控恒流源驱动电路进行调制，使LED发出频率为100 kHz的稳定的激发光。激发光一路经过365 nm滤光片照射在被测样品上，产生中心波长为450 nm的荧光信号，另一路经450 nm滤光片后由光电探测器检测，得到电压信号。由于荧光信号和得到的电压信号非常微弱，进一步设计了信号放大电路、100 kHz低通滤波电路、二级放大电路等信号调理电路对信号进行调理。最后，对于放大的100 kHz电压信号进行解调，得到滤除噪声和干扰的直流电压信号，进而由STM32F373的16位A/D进行模/数转换和处理。

为了进一步降低背景光、光源波动、光源衰减等带来的检测误差，设计了参考光检测电路，参考光检测电路和荧光检测电路采用同样的电路设计。

2.2 检测系统电路设计

在基于LED激发光源的荧光物质快速检测电路中，LED光源调制和恒流驱动以及信号解调电路是降低系统噪声、降低检测下限的关键[8]，下面将分别对荧光物质快速检测系统中的关键电路进行设计和分析。

2.2.1 LED激发光调制和恒流驱动电路

激发光源的稳定性是荧光检测系统中的关键，光源的不稳定将影响系统稳定性并产生检测误差。因此，荧光检测系统中，采用低纹波的压控恒流源作为LED的驱动电源，同时，可以通过调节电压的大小调节驱动电流的大小。

压控恒流源电路如图3(a)所示，STM32F373通过管脚3(DAC0)直接输出设定的电压值，接入运放同相输入端，根据“虚短”的概念，电阻器R2两端的电压V=DAC0，为恒定值，流过R2的电流I=V/R2，也为恒定值。再根据“虚断”的概念，流过R2的电流不流入运放，只流过Q1,Q2,Q3,Q4组成的威尔逊镜像恒流源，因此，LED的驱动电流LedCur+=DAC0/R2为恒定值，且可通过DAC0设定恒定电流的大小。

为了排除背景光等杂散光的影响并进一步提高信噪比，以100 kHz的方波对光源进行调制，光源调制电路如图3(b)右图所示。STM32F373的PWM产生100 kHz的方波，通过高速模拟开关对LedCur+进行通断控制，从而实现对LED激发光源的调制。

图3 LED的恒流驱动电路与光源调制电路

2.2.2 光电转换电路与带通滤波电路

光电转换电路主要用来将光信号转换成电信号，一般包括光电探测器与I/V(电流/电压)转换电路。由于荧光信号非常微弱，这对光电探测器以及I/V转换电路的灵敏度都提出了很高的要求。系统中，采用了Pacific Silicon Sensor公司的快速响应光电二极管作为光电探测器。

I/V转换电路采用了一种基于T型网络的高灵敏度I/V转换器，如图4(a)所示，可知

(1)

式中 i为光电二极管的输出电流;V为I/V转换电路的输出电压。合理选择R6，R7，R9等电阻值就能实现高灵敏度。

图4 T型网络I/V转换电路和100 kHz带通滤波电路

I/V转换得到的电压信号，含有直流分量、噪声以及其它干扰量，传统的低通滤波电路并不能滤除直流分量的干扰，系统通过基于光源调制—解调的巧妙设计，可完全消除直流分量的影响。由于光源调制的方波为100 kHz，因此，滤波电路采用了100 kHz巴特沃斯带通滤波电路进行设计，只有100 kHz的荧光信号可以通过，其他背景光、杂散光以及噪声信号等可以完全滤除。

100 kHz带通滤波电路如图4(b)图示，R10,C2和C1,R11分别决定高截止频率和低截止频率，选择合适的阻容值，将带通滤波范围设置在99 kHz和101 kHz之间。R1,R5和R8决定滤波电路的品质因数和增益。

2.2.3 信号解调电路及后置放大电路

对于调制的100 kHz信号，设计了全波精密检波电路，作为信号解调电路，对100 kHz荧光信号进行解调，从而得到直流的荧光信号。全波精密检波电路如图5所示，包括半波整流器电路、加法电路和低通滤波器电路。信号通过精密半波整流电路和加法电路组成的全波整流电路进行全波整流，然后经二阶巴特沃斯低通滤波器取出低频成分，从而获得解调的荧光电压信号。

图5 100 kHz信号解调电路

对于解调得到的荧光信号电压值，需要进一步放大到A/D检测的范围，以提高检测精度和分辨率。后置二级放大电路采用常规的比例放大电路，电路相对比较简单，这里不再给出具体电路和设计分析。

2.3 数据采集与处理

经过信号调理的荧光信号电压和参考光信号电压，由STM32F373两个通道的16位差分AD进行模/数转换。为了进一步提高信噪比，对于采集到的AD值，采用过采样和中值平均滤波算法进行处理。对荧光和参考光，分别连续采集64次，从小到大依次排列，取出中间4个值，求平均。最后，将荧光和参考光的比值，作为输入量送入由拟合得到的浓度计算公式，得到荧光物质的浓度。

3 实验结果与分析

3.1 荧光信号快速检测系统对比测试和标定

采用文献[9]所述方法，溶解4-MU并配置成1 mmol/L母液，避光保存。将母液进行梯度稀释，并用所设计的荧光物质快速检测系统与Bio-tek公司所生产的多功能酶标仪Synergy HT对其最低荧光物质检测浓度进行对比测试和对比标定，结果如图6所示。

图6 Synergy HT荧光值曲线和设计系统相对荧光值曲线

3.2 样品测试和结果分析

利用自制实验装置连续20次测量空白溶液的相对荧光值，通过计算其标准偏差(SD)为0.001 235，平均值(M)为0.013 591，具有较好的重复性。另外，以M+3SD作为最低检测限，则所设计的荧光物质检测系统的检测限为0.017 296 μmol/L。

将1 mmol/L的4-MU母液进行不同比例的梯度稀释，制成8个标准测试样本，由标定好的荧光物质检测系统进行测试，测试结果如表1所示。

表1 荧光物质快速检测系统测试误差对照表

从测试结果可以看出，所设计的荧光物质检测系统，与标准测试样本的测试误差均小于1.5 %，对于较低的0.031 25 μmol/L浓度的荧光物质，仍然可以准确地检测出。

实验测量中，放入样品后,0.5 s内数据可达到稳定，所以响应时间小于0.5 s，满足快速检测的要求。

4 结束语

针对生化检测和食品检测中常见的荧光物质4-MU的检测问题，设计了一种基于LED激发光源调制和解调的荧光物质快速检测系统，并给出电路实现。为了验证系统的性能，与多功能酶标仪进行了对比标定和测试，结果表明，所设计的系统线性度为0.997 9，检测误差小于1.5 %，响应时间小于0.5 s，这对于食品和生化荧光快速检测设备的开发，具有一定的参考意义。

[1] Mead J A R.The biosynthesis of the glucuronides of umbelliferone and 4-methylumbelliferone and their use in fluorimetric determination of beta-glucuronidase[J].Biochem J,1955,61:569-574.

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[9] Ziebold T.Precision and sensitivity in electron microprobe analysis[J].Anal Chem,1967,39:858-861.

Design of fluorescent substance rapid detection system based on LED excitation source*

GUO Li-quan1, YIN Huan-cai1,2, TIAN Jing-jing1,2

(1.Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology,Chinese Academy of Sciences,Suzhou 215163,China;2.Key Laboratory of Bio-Medical Diagnostics，Chinese Academy of Sciences,Suzhou 215163,China)

As a fluorescent substance,4-methylumbelliferone(4-MU)is widespread in food and biochemical tests.According to the detection of 4-MU,a fluorescent substance rapid detection method based on fluorescence analysis is proposed.LED as the excitation light source,a portable and high-sensitivity fluorescent substance rapid detection system is designed and realized.Comparison calibration and experiments are implemented between the system and multifunctional microplate reader.It is found that the linearity of the designed system is 0.997,and the detection error is less than 1.5 % and response time is less than 0.5 s.This research paves a reference for development of food and biochemical fluorescent substance tests device.

4-MU; fluorescent; fluorescent substance； rapid detection

10.13873/J.1000—9787(2017)05—0106—03

2016—06—10

江苏省科技计划资助项目(BY2014063，BY2015040—01，BY2015040—02)

Q 599

A

1000—9787(2017)05—0106—03

郭立泉(1983-),男，硕士，助理研究员，主要从事为医用电子学系统设计。

尹焕才(1982-)，男，通讯作者，博士，副研究员，从事检验医学仪器和体外诊断试剂方向研究工作，E—mail：yinhc@sibet.ac.cn。