干细胞动员对ALI大鼠TNF-α、IL-1β及肺泡表面活性物质保护作用分析

宋静 张蕴萍

·论著·

干细胞动员对ALI大鼠TNF-α、IL-1β及肺泡表面活性物质保护作用分析

宋静 张蕴萍

目的 探讨骨髓干细胞动员对急性肺损伤(ALI)大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)及肺泡表面活性物质的影响。方法 选取清洁级健康雄性SD大鼠60只，随机分为观察组和对照组，每组30只。2组大鼠建立ALI模型，其中观察组模型建立后皮下注射重组人粒细胞刺激因子(rhG-CSF)，对照组皮下注射等量0.9%氯化钠溶液。在干预后3 d、7 d和14 d每组处死10只，采用HE染色观察各期辐射状肺泡计数(RAC)值和湿/干重比，酶联免疫吸附法(ELISA)检测支气管肺泡灌洗液(BALF)TNF-α、IL-1β水平，双重免疫荧光染色检测BrdU和肺泡表面活性物质结合蛋白A(SP-A)表达。结果 观察组伤后3 d、7 d和14 d肺组织湿/干重比、IL-1β和TNF-α均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；观察组伤后3d、7d和14dRAC值明显多于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；观察组伤后3 d、7 d、14 d BrdU和SP-A双标阳性细胞标记率分别为(0.74±0.13)%、(1.40±0.23)%和(2.33±0.31)%，明显多于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 骨髓干细胞动员对ALI起保护作用，其保护作用涉及多种机制。

急性肺损伤；肿瘤坏死因子-α；白介素1β；肺泡表面活性物质；大鼠

急性肺损伤(acute lung injury)是一种临床常见的呼吸道疾病，主要是指肺内或肺外的损伤因素直接或间接损伤肺泡上皮和肺血管内皮细胞后导致肺毛细血管通透性增高，大量中性粒细胞浸润，进而引起肺部炎症性损伤，其可导致患者向急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)发展，最后导致呼吸衰竭而死亡[1,2]。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种多潜能细胞，也是目前细胞或组织替代治疗的种子细胞之一，其在适当条件下可迁移至肺脏并分化为上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞，进而达到修复损伤的作用[3,4]，但目前对于骨髓间充质干细胞动员治疗急性肺损伤的研究却较少，其治疗效果仍需做大量实验来进行验证。为此，本研究探讨骨髓干细胞动员对急性肺损伤大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)及肺泡表面活性物质的影响，为临床上治疗提供了一定的依据，报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取清洁级健康雄性SD大鼠60只，250～300 g，由大连医科大学动物实验中心提供，许可证号SCXK(军)2007-018。采用随机数字表法将大鼠随机分为观察组和对照组，每组30只。

1.2 实验方法

1.2.1 急性肺损伤模型建立:所有大鼠均建立急性肺损伤大鼠模型，具体方法如下：大鼠麻醉后胸背备皮，采用小型生物撞击机进行250 kPa撞击，以腋中线与右侧第四肋间交点为撞击点；随后立即注射15 mg/kg LPS(美国Sigma公司)，观察造模情况。

1.2.2 骨髓干细胞动员:观察组于造模后皮下注射重组人粒细胞刺激因子(中国医学科学院昆明医学生物研究所生产)30 μg·kg-1·d-1以动员自体骨髓干细胞，而对照组注射等量0.9%氯化钠溶液,连续5 d，观察并记录动物的死亡情况，并于动员的第6天抽血分离获取单个核细胞,BrdU标记后经静脉注入动物体内。

1.2.3 标本采集:分别于动员后3 d、7 d、14 d以过量3%戊巴比妥钠注射处死大鼠，将部分左肺组织于0.9%氯化钠溶液中迅速漂洗干净后，立即放入液氮中冷冻，后转入-70℃冰箱中低温保存备用，剩余左肺组以4%多聚甲醛固定，制备石蜡切片用于病理及免疫组化，冰冻切片用于免疫荧光检测。右肺以10 ml 0.9%氯化钠溶液灌洗3次，收集灌洗液800 r/min离心5 min，收集上清液置入-70℃冰箱保存。

1.2.4 双重免疫荧光染色:取冰冻切片采用免疫组化染色试剂盒进行染色，以小鼠单克隆抗BrdU和兔抗SP-C 多克隆抗体为一抗，以FITC 标记山羊抗小鼠和TRITC标记山羊抗兔Ig为二抗，以非特异血清代替一抗作为阴性对照，具体染色步骤按照试剂盒说明书进行。加DAB显色后在荧光显微镜观察染色结果并照相：呈绿色荧光的为BrdU 阳性细胞，呈红色荧光的为SP-C阳性细胞胞浆，黄色细胞为BrdU和SP-C双阳性细胞，所有细胞核均呈蓝色荧光。

1.2.5 TNF-α和IL-1β检测:采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测检测肺泡灌洗液(BALF)的TNF-α和IL-1β水平，检测仪器为酶标仪(德国拜发仪器公司，型号为880),TNF-α和IL-1β检测试剂盒购自上海超世生物科技有限公司，具体检测步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.6 形态学分析:将肺组织以多聚甲醛固定后作连续组织切片，HE染色后观察组织形态学变化。同时检测肺泡灌洗液中中性粒细胞数、总蛋白渗出量以及肺组织湿干比(W/D)。

2 结果

2.1 2组肺组织病理变化 伤后3d，对照组肺脏组织肺泡扩张不良，肺泡腔内中性粒细胞及巨噬细胞明显浸润，部分肺泡内出现蛋白渗出，肺泡壁增厚，毛细血管扩张重血，而观察组病变与对照组相似，但中性粒细胞及巨噬细胞较对照组减少；伤后7d，对照组仍有炎性细胞浸润，蛋白渗出更明显，毛细血管扩张充血及肺泡腔内出现仍存在，而观察组炎性细胞数量少，蛋白渗出程度减少。见图1。

图1 2组大鼠肺组织切片(HE×200)

2.2 2组肺组织湿/干重比、辐射状肺泡计数(RAC)、BALF中细胞因子含量比较 观察组伤后3d、7d和14d肺组织湿/干重比、IL-1β和TNF-α均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；观察组伤后3d、7d和14dRAC值明显多于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3 2组BrdU和SP-A双标阳性细胞比较 观察组伤后3d、7d、14dBrdU和SP-A双标阳性细胞标记率分别为(0.74±0.13)%、(1.40±0.23)%和(2.33±0.31)%，明显多于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2，图2。

3 讨论

急性肺损伤主要是指各种直接和间接致伤因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，其可造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，并导致急性低氧性呼吸功能不全[5,6]。急性肺损伤的病理生理特征主要为肺容积减少、肺顺应性降低、通气/血流比例失调，而患者的临床表现多为进行性低氧血症和呼吸窘迫，严重者可发展为ARDS，甚至导致死亡[7]。急性肺损伤的发病原因多与肺内损伤和肺外创伤有关，其损伤过程是一个涉及许多细胞活动的复杂过程，可分为早期的组织损伤(弥散性肺泡炎)和晚期的损伤后修复(肺间质重构)两个过程[8]。但急性肺损伤的发病机制目前尚不完全清楚，多数认为与炎性反应有关，而TNF-α、IL-1β等炎性因子在这一过程中发挥着重要作用[9]。

组别湿/干重比伤后3d伤后7d伤后14dIL⁃1(pg/ml)伤后3d伤后7d伤后14d对照组3．51±0．743．22±0．682．73±0．81352．94±51．03285．39±33．24201．18±40．07观察组2．74±0．522．53±0．701．93±0．68288．18±43．28190．30±28．16101．73±38．21t值2．6922．2362．3923．0616．9025．680P值<0．05<0．05<0．05<0．05<0．05<0．05组别TNF⁃α(pg/ml)伤后3d伤后7d伤后14dRAC值(个)伤后3d伤后7d伤后14d对照组134．29±21．93117．83±30．1087．57±24．179．84±0．8410．10±0．9412．26±1．81观察组101．33±19．8275．32±14．7451．28±30．2011．24±1．0313．73±1．1315．08±1．32t值3．5264．0113．944-3．331-7．810-3．981P值<0．05<0．05<0．05<0．05<0．05<0．05

组别伤后3d伤后7d伤后14d对照组0．00±0．000．34±0．090．75±0．10观察组0．74±0．131．40±0．232．33±0．31t值-18-13．572-15．339P值<0．05<0．05<0．05

图2 双重免疫荧光染色

A：BrdU单染呈绿色荧光；B：SP-A单染呈红色荧光；C：BrdU和SP-A双染阳性呈黄色荧光

目前临床上治疗急性肺损伤的主要方式为呼吸支持和抗炎治疗，但治疗效果并不理想[10]。骨髓干细胞动员是一种新兴的细胞移植方法，其主要是利用细胞因子使骨髓中的干细胞进入外周血，通过血液循环到达损伤组织，进而达到细胞移植的目的[11]。有研究表明，干细胞动员剂具有同时动员骨髓造血干细胞、间质干细胞及内皮干细胞的能力，而动员后骨髓的多种干细胞均可能参与组织器官的修复[12]。目前常用的动员剂主要有粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血管内皮生长因子和干细胞因子等，其中G-CSF是近年发现的骨髓干细胞强有力的动员剂之一[13]。研究表明，G-CSF是酪氨酸激酶受体c-Kit的配体，其应用后可使外周血的骨髓干细胞数量增高数十倍甚至数百倍，但对于骨髓干细胞动员能否在肺内定植并向肺上皮细胞分化并参与急性肺损伤的修复仍没有相关的报道[14]。

为了进一步探讨骨髓干细胞动员对急性肺损伤大鼠TNF-α、IL-1β及肺泡表面活性物质的影响，本研究利用创伤和LPS建立了大鼠急性肺损伤模型并分作2组，观察组皮下注射重组人粒细胞刺激因子(rhG-CSF)，而对照组皮下注射等量0.9%氯化钠溶液，观察并比较2组建模后3d、7d和14d时的RAC值和湿/干重比、肺泡灌洗液的TNF-α、IL-1β水平、BrdU和SP-A水平。LPS能促发肺泡表面活性物质减少，导致肺部出现急性肺泡渗出和中性粒细胞炎症。本研究中2组大鼠贼伤后3d均出现肺脏组织肺泡扩张不良、肺泡腔内中性粒细胞及巨噬细胞明显浸润部分肺泡内出现蛋白渗出等症状，但观察组的中性粒细胞及巨噬细胞较对照组减少；而伤后7d时对照组仍有炎性细胞浸润，蛋白渗出更明显，毛细血管扩张充血及肺泡腔内出现仍存在，但观察组的炎性细胞数量少，蛋白渗出程度减少，提示利用LPS可成功建立大鼠急性肺损伤模型，而皮下注射rhG-CSF进行骨髓干细胞动员后能明显改善大鼠的急性肺损伤症状，其可促进肺泡表面活性物质再生,并降低炎性细胞因子表达。进一步观察发现，观察组伤后3d、7d和14d肺组织湿/干重比、IL-1β和TNF-α均低于对照组(P<0.05)，而RAC值明显多于对照组(P<0.05)，提示皮下注射rhG-CSF进行骨髓干细胞动员可下调急性肺损伤大鼠的IL-1β和TNF-α等炎性因子的水平，进而阻止炎症反应的发展，并能促进肺组织损伤的修复，但具体机制仍需作进一步的研究。同时发现，观察组伤后3d、7d、14d时BrdU和SP-A双标阳性细胞标记率均明显多于对照组。SP-A是一种肺泡表面活性物质结合蛋白，主要由肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)合成和分泌，具有保护高氧肺损伤作用，并在维持肺的呼吸与非呼吸功能中起着重要作用[15]。本研究发现干细胞动员可促进ATⅡ合成和分泌SP-A蛋白，进而保护损伤的肺组织，改善急性肺损伤大鼠的急性肺损伤症状，但其机制仍需作进一步的深入研究。

综上所述，骨髓干细胞动员对急性肺损伤起保护作用，其保护作用涉及多种机制。

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Effects of stem cell mobilization on TNF-α, IL-1β and pulmonary alveolar surfactant in rats with acute lung injury

SONGJing,ZHANGYunping.
DepartmentofSenileDiseases,FriendshipHospitalofDalianCity,Liaoning,Dalian116000,China

Objective To investigate the effects of bone marrow stem cell mobilization on tumor necrosis factor-α(TNF-α),interleukin 1β (IL-1β) and pulmonary alveolar surfactant in rats with acute lung injury (ALI).Methods Sixty clean grade healthy male SD rats were randomly divided into observation group and control group,with 30 rats in each group.The animal models with ALI were established in the rats of both groups.After modeling the rats in observation group were given recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (rhG-CSF) by subcutaneous injection,however,the rats in control group were given the same volume 0.9% sodium chloride solution,then the 30 rats in each group were sacrificed on 3d,7d,14d after intervention,respectively,and the radial alveolar counts (RAC) at different periods and the ratio of wet/dry weight were detected by HE staining, the levels of IL-1β and TNF-α in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were measured by ELISA,and the expression levels of BrdU and pulmonary surfactant protein A (SP-A) were detected by double immunofluorescence staining.Results The ratio of wet/dry weight and the levels of IL-1β and TNF-α on 3d,7d,14d after lung injury in observation group were significantly lower than those in control group (P<0.05),however,TheRACvalueson3d,7d,14dafterlunginjuryinobservationgroupweresignificantlyhigherthanthoseincontrolgroup(P<0.05).TheBrdUandSP-Adoublepositivecellslabelingrateson3d,7d,14dafterlunginjuryinobservationgroupwere(0.74±0.13)%,(1.40±0.23)%,(2.33±0.31)%,respectively,whichweresignificantlyhigherthanthoseincontrolgroup(P<0.05).Conclusion The bone marrow stem cells mobilization has a protective effect on ALI,and its protective effect may be involved in multiple mechanism.

acute lung injury; tumor necrosis factor α; interleukin 1β; pulmonary surfactant; rats

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.09.009

项目来源：大连市卫生局科研基金项目(编号：WSJ/KJC-01-JL-01)

116000 辽宁省大连市友谊医院老年病科

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A

1002-7386(2017)09-1316-04

2016-12-07)