扫描离子电导显微镜微探针的性能评价

尹曙光+刘晓

摘 要：扫描离子电导显微镜技术是纳米生物医学领域新近发展起来的一种扫描探针显微镜技术，可被用来在生理条件下、高分辨率及非接触地研究活细胞的表面形貌。扫描用玻璃微探针的性能直接影响扫描探针显微镜的分辨率和拓扑成像质量，因此玻璃微探针的制备在实现纳米生物样品的高分辨率探测中具有重要的意义。文章运用扫描电子显微镜直接观测玻璃微探针的几何形状进而推算电阻值，借助膜片钳技术测量微探针实际电阻，并通过应用该种玻璃探针对标准样品进行扫描成像来判断该微探针是否满足实验需要，最终综合上述数据对纳米尺度玻璃微探针的性能进行评价。

关键词：扫描离子电导显微镜；纳米技术；玻璃微探针

扫描离子电导显微镜（Scanning Ion Conductance Microscopy，SICM）凭借探针跳跃的非接触扫描方式成为了目前最适合在生理液态环境中实时观察活体生物样品表面三维拓扑形貌的一种极具应用前景的扫描探针显微镜技术[1，2]。它采用交流调制式负反馈控制技术和超纳米精度的压电陶瓷控制玻璃微探针在样品表面以恒定距离扫描，记录玻璃微探针的运动轨迹即可获得样品表面三维形貌[3]。因此，作为SICM感知样品表面的唯一工具，玻璃微探针针尖的性能成为决定显微镜分辨率的关键性因素。

本文中我们对激光熔拉法拉[4]制出的玻璃微探针进行了高分辨率扫描电镜观测，获得探针形态与针尖尺度参数，通过公式计算与膜片钳实测针尖电阻的方法来评价制备出的纳米玻璃微探针的性能。

1 微探针性能在扫描离子电导显微镜技术中的重要性

微探针是SICM进行纳米尺度扫描成像的重要探测工具，其性能的优劣直接影响SICM的成像质量。此外，不同的扫描对象和扫描环境条件也对微探针针尖的曲率半径和纵横比等性状提出了不同的要求。因此，对微探针的性能进行评价就显得十分必要。

SICM玻璃微探针尖端的几何形状与采集到的数据的真实性密切相关。如图1所示，当对台阶状区域进行探测时，圆形针尖成像得到的是圆滑台阶（图1a）；锥形针尖成像得到的是倾斜台阶（图1b）；当针尖的锥度大于样品的微观尺寸时，由于针尖的曲率半径相对较大，不仅无法准确探测样品的表面形貌（图1c）；而且还会产生横向的位移误差（图1d）；针尖的曲率半径越小，锥度越小，测量结果将越接近样品的真实形貌（图1e）。因此，为了提高测量结果的精度，在探针制备时，应尽量选择小曲率半径和小锥度的微探针。

SICM微探针是由硅酸盐玻璃或石英玻璃微管（外径1.00mm， 内径0.59mm）拉制而成的纤细的玻璃微探针，也称为玻璃微电极，为了方便向探针针尖内充灌液体一般玻璃微管内含导液丝（图2）。借助扫描电镜对玻璃微探针针尖的横截面进行成像可以清晰地观察到玻璃微管中的导液丝。导液丝是一根玻璃纤维原丝，而每根原丝又由成百上千根单丝组成，它利用毛细现象的引流作用使得液体更容易注入针尖而不形成气泡。

为了描述的方便，研究人员往往把玻璃微探针人为地分成三个部分，如图3所示，为普通光学显微镜下观察到的玻璃微探针。左侧红框中是探针的尖部，中间的红框是探针的颈部，右侧的红框是探针的肩部。因为SICM的分辨率与玻璃微探针尖端内径尺寸为同一数量级，要达到50-100纳米的高分辨率，相应的玻璃微探针尖部的内径尺寸应在同样尺度。探针的肩部应具有良好的轴对称性，如果探针的对称性不好，会使得探针不是垂直于被测样品之上，导致探针的定位与扫描产生误差，直接影响负反馈控制的灵敏性。此外，为了减少针尖的振动增加扫描时的稳定性，探针的颈部也要尽可能短以增加玻璃探针的刚度。

简而言之，一支好的SICM微探针应具备以下四点：第一，探针针尖的粗细要满足分辨率的要求；第二，探针要有大的锥角；第三，探针的肩部要轴对称；第四，探针的颈部要尽可能短。

2 微探针的扫描电镜观测与电阻测量

我们使用美国Sutter Instrument P-2000型程控水平激光微电极拉制仪拉制硼硅酸盐或石英玻璃微电极毛细管来制备SICM微探针。为了检测该玻璃微探针尖端内径尺寸是否达到了50-100 nm，是否具备良好几何形态，我们将拉制好的玻璃微探针进行喷金处理后，用导电胶带粘到载物台上，借助LEO1530VP 型扫描电镜直接观测玻璃微探针针尖的形状。

扫描电镜成像得到的玻璃微探针成像显示探针针尖形状对称（图4），利用扫描电镜分析软件测量出玻璃微探针尖端内半径（ri）为27nm，外半径（ro）为60nm （图4A、B）。该玻璃微探针的内壁半角θ为2.7°。通过下面的玻璃微探针电阻计算公式，可以估算出该玻璃微探针在充灌电极内液后的理论电阻值。

公式中：Rp为玻璃微探针电阻，ξ为玻璃微探针内液（0.15mol/L KCl）的电导率，ri为玻璃微探针针尖的内半径，θ为玻璃微探针针尖的内壁半角。采用该公式估算得到该玻璃微探针的电阻约为130MΩ。

采用上述的拉制条件，拉制多根具有相近针尖形状的玻璃微探针进行膜片钳电阻测量的实验。将充灌有0.15mol/L KCl的玻璃微探针连接到商用膜片钳Multiclamp 700B 放大器上，通过Clampex 12.0软件测量得到微探针的实际电阻值为137.6±24.7MΩ（n=16），并且电阻值稳定。

根据扫描电镜测得的玻璃微探针针尖形状数据计算出的玻璃微探针的电阻值与膜片钳测得的玻璃微探针的实际电阻进行分析比较，发现这两种方法得到的玻璃微探针电阻值基本一致。玻璃微探针的电阻直接影响流入探针针尖离子电流的强度，从而影响到SICM的负反馈扫描控制，用传统的膜片钳电阻测量方法分析玻璃微探针性状的方法更加简便快捷，可直观、可靠地判定玻璃微探针的形态和拉制质量。

3 标准样品的扫描成像

为了检测上述拉制条件下拉制的玻璃微探针是否满足实验需要，我们选择尖端内壁直径约50nm，电阻值约150MΩ的玻璃微电极作为SICM扫描探针，对标准样品（Platinum coated calibration grid，10μm pitch，200nm deep，3D reference）進行扫描成像。图5是一幅40×40μm标准样品的SICM成像。该图清晰地呈现出样品任意相邻两孔之间的距离为10μm， 并且深为200nm的标准阶台结构清晰可见。这说明该玻璃微探针完全可以实现高分辨率扫描成像，并且无漂移、拖尾等现象。

4 结束语

玻璃微探针在SICM中的作用举足轻重，因为探针的优劣会直接影响到SICM的分辨率和负反馈控制的稳定性，是实现SICM稳定高质量成像的基础。为了实现扫SICM技术的高分辨生物样品成像，玻璃微探针的制备是该技术走向扫描应用的第一步，也是最基础、最重要的一步，必须制备出性能优良的纳米尺度玻璃微探针。本文对SICM技术中使用的硼硅酸盐和石英玻璃微探针针尖形状进行了观测，并根据观测数据推算出了玻璃微探针的电阻值，该电阻值与膜片钳测得的玻璃微探针电阻基本一致。利用该探针我们得到了标准样品的高分辨率成像，这表明用Sutter Instrument P-2000型程控水平激光微电极拉制仪拉制的硼硅酸盐和石英玻璃微探针的性能稳定能够满足SICM技术高分辨率扫描的要求。

参考文献

[1]Novak P，Li C，Shevchuk AI，et al.Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy.Nat. Meth，2009，6：279-281.

[2]杨茜，刘晓，马丽颖，等.非接触式扫描离子电导显微镜技术在探测活体细胞表面微结构中的应用[J].电子显微学报，2009，28（5）：48

9-494.

[3]杨茜，刘晓，张晓帆，等.基于扫描离子电导显微镜负反馈扫描控制技术的高分辨率膜片钳技术[J].生理学报，2010，62（3）：275-283.

[4]Yang X，Liu X，Lu H，et al.Real-time investigation of acute toxicity of ZnO nanoparticles on human lung epithelia with Hopping Probe Ion Conductance Microscopy.Chemical Research in Toxicology，2012，25：297-304.