抗高原反应中药红景天化学成分的潜在靶标研究

梁子亮，张旭毅，欧阳璞心，王 藩，刘海峰，刘惠亮

抗高原反应中药红景天化学成分的潜在靶标研究

梁子亮，张旭毅，欧阳璞心，王 藩，刘海峰，刘惠亮

目的红景天作为抗高原反应的常用中药，其化学成分的作用靶标和机制一直未得到明确阐释，本研究从文献调研的187种红景天化学成分出发，针对缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)降解途径的10个靶标，利用AutoDock Vina分子对接程序，对化学成分和靶标之间的相互作用进行研究。方法（1）构建了187种化学成分数据库；（2）对靶标晶体结构进行复原测试，以均方根偏差（root-mean-square deviation，RMSD）进行评价，最终确定靶标蛋白对接参数，成功构建10个靶标信息的靶标数据库；（3）对化合物数据库的187个化合物与靶标数据库的10个靶标及其参数进行两两分子对接，得到排名前5%的化合物为阳性化合物，构建化合物-靶标相互作用网络图。结果红景天中的18种化学成分与3个以上的靶标有相互作用，验证了红景天多靶点作用的分子机制。结论在所筛选出的化合物中，化合物15（Rhodionin）、16（Rhodiosin）、26（Crenulatin）、56（Pharienside）和184（Pyridrde）是已报道的红景天的药理活性成分，本研究分别将其结构及对应作用靶标罗列出来，为红景天药理成分的靶标确定及后期研发提供参考。

红景天；高原反应；靶标；HIF-1α；分子对接

武警官兵高原训练及灾害救援时常发生高原反应，对工作进程及效果造成严重影响。红景天（Rhodiola roseaL.）为我国传统藏药用植物，具有与人参、刺五加类似的“适应原样”作用，具有抗缺氧、抗氧化、抗疲劳和抗肿瘤等功效[1]。研究表明，红景天调节心肌细胞中的缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）表达是治疗高原缺氧的途径之一，其促进HIF-1α及其下游血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达可能是其抗缺氧的作用机制，红景天诱导HIF-1α表达增加主要通过抑制HIF-1α的降解，而不是增加HIF-1α mRNA翻译[1]。研究表明，红景天可通过抑制HIF-1α蛋白降解，增加HIF-1α稳定性[2]。

本研究以文献收集的红景天化学成分为对象，采用AutoDock Vina软件的分子对接方法[3]，分析红景天化学成分与HIF-1α降解途径靶标的关系，试图从HIF-1α降解途径切入，了解红景天的潜在作用靶标，为红景天治疗急性高原反应的机制提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 天津中医药大学周江韬等[4]对红景天近二十年分离鉴定的化学成分进行总结，得到187种化合物。

1.2数据库构建 针对这187种化合物构建红景天化学成分数据库，首先采用ChemBioOffice中的ChemDraw软件画结构，保存为cdx文件（二维结构）；然后将化合物导入Chem3D转换为三维格式并用MM2力场进行能量优化，优化完成后保存为mol2格式文件；最后用AutoDock Tools进行蛋白准备，包括加H、加电荷和格式转换，保存为pdbqt文件。值得注意的是，化合物184的结构与其他文献[5，6]有所出入，经过调研，最终确定184的结构，且最终构建得到的红景天化学成分数据库为pdbqt格式，化合物结构和编号均与文献[4]保持一致，见表1。

表1 化合物184结构

1.3HIF-1α降解途径靶标的准备

1.3.1靶标的确定 本研究以HIF-1α降解途径相关靶标为研究对象。HIF-1α的降解途径有肿瘤抑制蛋白（von Hippel-Lindau protein, pVHL）依赖途径和非pVHL依赖途径两类。（1）pVHL依赖途径。在常氧状态时，HIF-1α的PRO402和PRO564位点能够被脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase，PHD）识别并羟基化，被羟基化的HIF-1α与pVHL结合，而pVHL能够富集elongin-C/elongin-B/cullin-2 E3泛素连接酶，最终经过26S蛋白酶体介导降解[7,8]。在此O2/ pVHL/PHD途径中，有研究表明，乙酰转移酶（arrest-defective-1，ARD1）乙酰化HIF-1α的LYS532，将增强其与pVHL蛋白复合体的结合[9]；骨肉瘤-9（osteosarcoma-9，OS-9）能够通过与HIF-1α/PHD2或HIF-1α/PHD3复合物结合而促进降解[10]；（spermidine/spermine-N1-acetyltransferase-2，SSAT2）与pVHL/E3连接酶结合[11]；最终均能促进HIF-1α的降解。（2）pVHL非依赖途径。除了pVHL途径，受体激活C-激酶1（receptor for activated C-kinase1，RACK1）也可富集elongin-C/elongin-B/cullin-2 E3泛素连接酶诱导其泛素化降解[12]；人精脒/精胺N1-乙酰基转移酶1（spermidine/spermine-N1-acetyltransferase-1， SSAT1）则能稳定RACK1和HIF-1α的相互作用[13]；糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）通过对HIF-1α的磷酸化修饰促进非pVHL途径HIF-1α降解[14]。此外，E3连接酶（human double minute 2，Hdm2）[15]，叉头状转录因子O4（forkhead transcription factor O4，FOXO4）均被报道有促进HIF-1α降解作用。

因此，笔者所在团队选择能够促进HIF-1α降解途径的pVHL、PHD、ARD1、OS-9、SSAT2、RACK1、SSAT1、GSK3β、Hdm2和FOXO4等10个靶标为目标靶标。如果红景天与其中的靶标结合并抑制其活性，HIF-1α的降解途径将会被抑制，稳定性得到增加。

1.3.2靶标晶体结构和活性位点的确定 确定上述10个目标靶标后，进一步确定靶标的三维晶体结构用于计算模拟。首先，通过NCBI数据库对上述靶标名称分别进行检索，得到该靶标的基因和序列信息；然后，用靶标序列与PDB数据库进行序列比对，以一致性（identity）和覆盖率（coverage）作为判断标准，一致性大于30%、覆盖靶标功能域的晶体结构作为候选靶标晶体结构蛋白；若一个靶标通过序列比对得到多个晶体结构蛋白，则解析度高、序列长度完整、包含配体分子的蛋白结构优先考虑。

晶体结构活性位点以原配体所在位置为准，对于无配体的RACK1靶标，通过文献调研确定其活性位点。研究表明，RACK1通过7个WD重复结构域与细胞内特殊蛋白质相互作用[13]，其与HIF-1α是通过二聚体中的WD6结构域进行结合[14]。因此，笔者所在团队划定RACK1晶体结构4AOW的WD6位置为活性位点（图1）。

图1 RACK1（PDB编号4AOW）晶体结构

1.4分子对接条件测试 在分子对接前，需对分子对接方法和参数进行测试验证，以确定其适用于该体系的计算模拟工作。常用的复原测试方法为将靶标蛋白晶体结构配体对接到该靶标蛋白上，如能重现晶体结构配体构象（RMSD≤2.0 A），则复原成功，可用于下一步的靶标蛋白-化合物分子对接工作。

无配体分子的靶标RACK1和脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）结合的FOXO4排除在外，其他8个靶标蛋白均做复原测试，来调整和确定分子对接参数。分子对接采用AutoDock Vina软件，需要准备好蛋白文件、配体文件和活性位点参数文件。蛋白质准备首先用Pymol软件去除水、溶剂和配体分子，然后用AutoDock Tools加H、加电荷；配体分子准备包括用Pymol软件导入晶体结构中配体，以及用AutoDock Tools软件对其加H、加电荷等操作；活性位点参数文件（X_center，Y_center，Z_center；X_size， Y_ size， Z_size）限定对接盒子的中心和大小，不同靶标体系的盒子设置不尽相同。最后，复原结果好坏用对接后构象与配体构象的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）来评价。

由表2可见，靶标ARD1、GSK3β、Hdm2、PHD2、pVHL和SSAT2对接后构象与晶体结构配体构象的RMSD值均≤2.0 A，复原成功；而靶标OS-9和SSAT1的复原RMSD＞2.0 A，复原失败。

表2 复原参数和结果

由图2A-C可见，靶标OS-9复原结果，MAN301、MAN302两个糖环能够较好地复原，而BMA300相差较大（图2A）。分析晶体结构发现，BMA300-MAN301-MAN302组成的多糖结合在蛋白表面，与完全包埋在蛋白口袋内的配体相比，蛋白口袋信息较少，模拟难度较大；结合模式上，对接后构象（图2C）保留了原配体构象（图2B）与蛋白残基TRP118、GLN130、GLU212和TYR218的主要氢键相互作用，而以较弱的范德华力结合（图2B）的BMA300未能复原成功，对接后构象的BMA300基团更偏向于与TYR120、GLU212以更强的氢键作用结合。

SSAT1的复原结果（图2）显示，其包埋在蛋白口袋内的脂肪链可以较好地重合（图2D），主要的氢键相互作用也能很好地复原（图2E，2F），蛋白口袋外的嘌呤环复原失败，与OS-9类似，均由于该基团周围的蛋白环境信息太少，导致计算模拟较难复原。

因此，OS-9和SSAT1的配体中主要基团（蛋白口袋内）能够较好地复原重合，蛋白活性口袋外的基团复原失败，均为体系原因所致，对接参数和方法仍可以接受，用于后续的分子对接工作。

图2 靶标OS9和SSAT1复原结果

1.4靶标数据库的构建 将分子对接条件测试后准备好的蛋白质文件（pdbqt格式）和活性位点参数文件（txt文件）保存，构成pVHL、PHD、ARD1、OS-9、SSAT2、RACK1、SSAT1、GSK3B、Hdm2和FOXO4 10个靶标的靶标数据库。

1.5红景天化学成分与靶标的分子对接 将靶标数据库中的10个靶标文件与化合物数据库中的187个化合物两两分子对接，对接软件为AutoDock Vina，活性位点参数为靶标数据库中的文本文件，分子对接参数设置生成构象数（num_modes）为20，其他参数默认。

2 结 果

2.1靶标与化合物相互作用 每个靶标和187个化合物的得分按照亲和力排序，将前5%（Top9）的化合物作为阳性结果，认为其与对应靶标能够结合，若Top9有多个相同得分的化合物，所有相同得分的化合物均保留，10个靶标的前5%化合物个数为9到13个不等（表3）。另外，分子对接得分与靶标体系相关，化合物-靶标的相互作用需针对某个特定靶标相对来看，靶标间的数值无可比性。

表3 排名前5%结果信息列表

将上述靶标-化合物相互作用信息导入Cytoscape软件构建网络图，可以看到（图3），与化合物45、29、169、16相互作用的靶标个数分别是8、6、6、5；化合物5、17、31、181和187与其中4个靶标有相互作用；化合物3、4、6、9、15、26、27、168和182与其中3个靶标有相互作用。由此可知，红景天能够很好地发挥中药多成分多靶点的优势，其可能通过氧依赖的pVHL途径来抑制HIF-1α降解，提高HIF-1α稳定性，激活下游的多个靶标基因，也可能是通过RACK1途径达到这一目的。

2.2已知活性成分与多靶标化合物 在与HIF-1α降解靶标相互作用的化合物中，化合物15（Rhodionin）[14]、16（Rhodiosin）[5]、26（Crenulatin）[13]、56（Pharienside）[14]和184（Pyridrde）是已报道的红景天的活性成分。

2.3化合物56与靶标SSAT1结合模式 以化合物56为例，分析其与靶标SSAT1的结合模式，作为化合物-靶标相互作用的参考。从结合模式图（图4A）可以看到，化合物56苯环和糖环上的羟基与残基GLU28、GLU92、ASP93、PHE94、GLY102、PHE103、GLY104、ILE105、SER107、LEU128和ARG143形成氢键相互作用，连接段的苯环与PHE94、PHE139和TYR140的芳香口袋形成芳香堆砌作用，脂基与SER136和TYR140形成氢键作用；静电势图（图4B）可以看到，化合物56能够较好地与SSAT1的口袋契合，苯环与疏水口袋形成疏水和范德华作用力，糖环与正电性口袋形成静电互补。

图3 化合物-靶标相互作用网络图

图4 化合物56与靶标SSAT1的结合模式

3 讨 论

武警官兵高原训练常发生高原反应，尤其是刚进入高原的新兵，高原反应较为严重，不仅增加了官兵的心理负担，还对整个训练进程和效果造成影响。红景天是抗高原反应的有效中药，考察其活性成分的可能作用靶标有助于了解其抗高原反应的作用机制和应用，但过分依赖于单味成分并不能完全反映红景天中药复方的实际组成和效应。HIF-1是一种与缺氧有关的重要转录调节因子，为α亚基和β亚基组成的异二聚体，常氧状态下，HIF-1α蛋白经泛素蛋白酶系统快速降解[14]，低氧状态下，HIF-1α的蛋白降解受到抑制，与HIF-1β亚基形成具有转录活性的异二聚体HIF-1，并与靶基因启动子区域的缺氧反应元件(hypoxia response element，HRE)结合来激活包括VEGF、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）等在内的近60个靶基因的转录功能，引发一系列生理效应[2,14,15]。

本项目针对HIF-1α的降解途径研究红景天化学成分的潜在作用靶标，分析10个降解途径相关靶标和化合物的相互作用，但这并不是红景天作用的唯一途径，除了直接作用HIF-1α降解途径相关靶标，其还可能通过通路间接调控HIF-1α降解靶标[14]；除降解途径外，红景天也可能通过其他途径，比如HIF-1α合成途径来增加HIF-1α的稳定性[12]，激活其下游靶标基因。

本研究建立了红景天187种化学成分的化合物数据库（pdbqt文件），构建了HIF-1α降解途径的10个靶标数据（蛋白pdbqt文件和活性位点参数文件），用分子模拟的方法预测化学成分与靶标的相互作用，结果发现，红景天的多种化学成分能够同时作用于HIF-1α降解途径相关的多个靶标，

此外，已报道的药理活性成分15（Rhodionin）、16（Rhodiosin）、26（Crenulatin）、56（Pharienside）和184（Pyridrde）的潜在作用靶标的相互作用也被预测出来，为红景天化学成分作用靶标及机制研究提供参考。

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（2016-12-20收稿2017-01-12修回）

（本文编辑 孙秀明）

Potential target of chemical constituents from the Rhodiola plants

LIANG Ziliang, ZHANG Xuyi, OUYANG Puxin， WANG Fan, LIU Haifeng, and LIU Huiliang. Department of Medical Office, General Hospital of Chinese People's Armed Police Force, Beijing 100039, China
Corresponding author: LIU Huiliang, E-mail: lhl518@vip.sina.com

ObjectiveRhodiolais a commonly used drug for resistance to altitude sickness, however the target of its chemical constituents and mechanism of action have not been clearly explained. In this paper, 187 chemical constituents ofRhodiolawere collected through a literature review, AutoDock Vina, a molecular docking program, was used to predict the interaction between chemical constituents and 10 identifiable targets of (hypoxia-inducible factor 1α) HIF-1α degradation pathway.Methods(1) A database comprising of the 187Rhodiolachemical components was built; (2) A recovery test was performed on 10 target proteins with root-mean-square deviation (RMSD) as the evaluation criterion, the docking parameter was identified and target database was built; (3) Molecular docking between 187 chemical components and 10 targets, and as well as their parameters were run through the databases. The top 5% chemical components were regarded as positive to establish the compound-target interaction network graph.Results18 compounds inRhodiolainteracted with more than 3 targets, which proved the muti-target molecular mechanism ofRhodiola.ConclusionsSome active constituents previously reported had been screened out, such as Rhodionin, Rhodiosin, Crenulatin, Pharienside and Pyridrde. The structure and target information was listed to provide reference for the determination of targets and future research and development on pharmaceutical components ofRhodiola.

Rhodiola; altitude sickness; target; HIF-1α; molecular docking

O64

10.13919/j.issn.2095-6274.2017.04.002

首都医学发展专项( 2014-2-5131)；武警总医院院级课题（WZ2015008）

100039 北京，武警总医院医疗科

刘惠亮，E-mail：lhl518@vip.sina.com