鬼伞属真菌的杀线虫活性

丁正蛟，孟 帅，刘亚君

(云南大学 云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650091)



鬼伞属真菌的杀线虫活性

丁正蛟，孟 帅，刘亚君*

(云南大学 云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650091)

研究了10种鬼伞属真菌对全齿复活线虫的毒杀活性，并用HPLC法分析了杀线虫毒素在各真菌中的分布。结果表明，有7种鬼伞属真菌表现出明显的杀线虫活性，且杀线虫活性与其杀线虫毒素的分布呈正相关。

鬼伞属；杀线虫活性；杀线虫毒素

迄今为止，已发现约21属90多种担子菌可以捕食线虫。Luo等[1]报道毛头鬼伞(C.comatus)可以捕杀全齿复活线虫(Panagrellus redivivus)和根结线虫。研究发现，鬼伞属真菌的杀线虫活性与杀线虫毒素密切相关，毛头鬼伞含有多种杀线虫毒素[2]。作者在此研究了10种鬼伞属真菌对全齿复活线虫的毒杀活性，测定了杀线虫毒素的分布，建立了每种真菌的代谢物HPLC图谱，构建了化学成分相似性聚类树，以期找到代谢物和杀线虫活性之间的相关性，为深入研究鬼伞属真菌的杀线虫活性提供帮助。

1 实验

1.1 真菌的培养

10种鬼伞属真菌均保藏于云南生物资源保护与利用国家重点实验室的培养物保藏中心。 将10种真菌分别接种于马铃薯葡萄糖培养基(直径9cm培养平板)上，22 ℃静置培养12d，提取代谢物。每种真菌做3个平行。

1.2 代谢物的提取

代谢物的提取参照Smedsgaard[3]和Andersen等[4]建立的微萃取法并加以改进。用100mL氯仿-甲醇(1∶1，体积比)浸提10种真菌培养物； 然后用100mL乙酸乙酯萃取残余物，最后用100mL丙醇萃取；合并所有萃取物，减压蒸发溶剂，干燥，得代谢提取物。

1.3 代谢物化学成分的测定

将干燥的代谢提取物溶解于1mL甲醇中，经0.45μm滤膜过滤，以从毛头鬼伞中分离的一系列杀线虫毒素作为外标，采用HPLC法测定代谢物的化学成分。

HPLC色谱条件：Agilent1100系统(Agilent，USA)，SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm，Agilent，USA)，DAD检测器全扫描，5%～100%乙腈线性梯度洗脱，流速1.0mL·min-1，60min。 所用化学品均为Merck公司HPLC级，水为双蒸水。

1.4 杀线虫活性的测定

将全齿复活线虫置于燕麦片培养基(燕麦片20g+水80mL)上于25 ℃培养7d，通过Baermann漏斗法[5]从培养基中分离线虫。

杀线虫活性的测定参照文献[6]的方法。

1.5 数据分析

将10种真菌代谢提取物的HPLC图谱与总图谱进行比较，其中毒素存在的赋予值“1”，毒素缺乏的赋予值“0”。以毛头鬼伞的色谱图为标准，采用UPGMA法构建化学成分相似性聚类树。

2 结果与讨论

2.1 鬼伞属真菌的杀线虫活性

10种鬼伞属真菌培养物和提取物的杀线虫活性如表1所示。

表1 10种鬼伞属真菌培养物和提取物的杀线虫活性

Tab.1 Nematicidal activities of culture and extract from ten kinds of Coprinus fungi

注：“++”表示线虫致死率在80%以上(18 h)，“+”表示线虫致死率在50%～80%(18 h)，“-”表示线虫致死率小于 50%(18 h)。

由表1可知，在10种鬼伞属真菌中，4#、5#、6#真菌的培养物和提取物都具有明显的杀线虫活性，7#、8#、10#真菌的培养物和提取物有一定的杀线虫活性，1#、2#、3#真菌的培养物和提取物杀线虫活性很弱，9#真菌的培养物杀线虫活性也很弱，但其提取物具有较强的杀线虫活性。表明，部分鬼伞属真菌具有杀线虫活性，且杀线虫活性强度不同。

2.2 鬼伞属真菌杀线虫毒素的分布

从毛头鬼伞中分离得到的7种杀线虫毒素(Ⅰ～Ⅶ)在10种鬼伞属真菌中的分布情况如表2所示。

表2 杀线虫毒素在10种鬼伞属真菌中的分布

Tab.2 Distribution of nematotoxin in ten kinds of Coprinus fungi

注：Ⅰ为5-methylfuran-3-carboxylic acid；Ⅱ为5-hydroxy-3,5-dimethylfuran-2(5H)-one；Ⅲ为5-hydroxy-3-(hydroxymethyl)-5-methylfuran-2(5H)-one；Ⅳ为4,6-dihydroxyisobenzofuran-1,3-dione；Ⅴ为4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one；Ⅵ为4,6-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one；Ⅶ为3-formyl-2,5-dihydroxybenzyl acetate。“+”表示检测到杀线虫毒素，“-”表示未检测到杀线虫毒素。

由表2可知，在7种真菌中检测到了杀线虫毒素同系物，与它们的杀线虫活性相对应。比较表1和表2发现：9#真菌没有检测到杀线虫毒素但其代谢提取物却有着较强的杀线虫活性，而杀线虫活性较强的7#真菌的杀线虫毒素分布不如杀线虫活性较弱的8#真菌，这可能是因为，鬼伞属真菌中可能还存在其它具有杀线虫活性的化合物，而不仅仅只有杀线虫毒素Ⅰ～Ⅶ；1#真菌虽检测到杀线虫毒素但杀线虫活性却很弱，可能是因为所含杀线虫毒素的含量较低所致。

2.3 鬼伞属真菌化学成分相似性聚类树分析

基于10种鬼伞属真菌的杀线虫毒素分布(表2)进行聚类分析得到的树形图如图1所示。

从图1可以看到， 10种鬼伞属真菌被归在2个不同的簇。一个簇包括强杀线虫活性的3个物种，另一个簇中物种的杀线虫活性不明显；具有相似活性的物种在聚类距离上接近。这表明鬼伞属真菌的杀线虫活性和其杀线虫毒素的分布呈正相关。

图1 10种鬼伞属真菌化学成分相似性聚类树Fig.1 Cluster tree of ten kinds of Coprinus fungi based on chemical composition similarity

3 结论

所测试的10种鬼伞属真菌中有7种对全齿复活线虫有明显的毒杀活性，且其毒杀活性与杀线虫毒素的分布呈正相关。若能对影响杀线虫活性的代谢物进行进一步的分离和鉴定，必会为鬼伞属真菌杀线虫特性提供更多的证据。

[1] LUO H,MO M H,ZHANG K Q.An unusual structure designated spinous ball was found on a nematophagousBasidiomycetousfungusCoprinuscomatus[J].Mycological Research,2004,96：1219-1226.

[2] 刘亚君.鬼伞属真菌杀线虫活性化合物分离、鉴定[D].昆明：云南大学,2005.

[3] SMEDSGAARD J.Micro-scale extraction procedure for standardized screening of fungal metabolite production in cultures[J].Journal of Chromatography A,1997,760(2):264-270.

[4] ANDERSEN B,KROGER E,ROBERTS R G.Chemical and morphological segregation ofAlternariaalternata,A.gaisenandA.longipes[J].Mycological Research,2001,105(3):291-299.

[5] GRAY N F.Ecology of nematophagous fungi:comparison of the soil sprinkling method with the Baermann funnel technique in the isolation of endoparasites[J].Soil Biology & Biochemistry,1984,16(1):81-83.

[6] STADLER M,ANKE H,BERGQUIST K E,et al.Lachnumon and lachnumol A,new metabolites with nematicidal and antimicrobial activities from the ascomyceteLachnumpapyraceum(Karst.) Karst.Ⅱ.structural elucidation[J].Journal of Antibiotics,1993,46(6):968-971.

Nematicidal Activity ofCoprinusFungi

DING Zheng-jiao,MENG Shuai,LIU Ya-jun*

(StateKeyLaboratoryforConservationandUtilizationofBio-ResourceinYunnan,YunnanUniversity,Kunming650091,China)

NematicidalactivitiesoftenkindsofCoprinusfungiagainstPanagrellus redivivuswerestudied.DistributionofnematotoxininvariousfungiwasanalyzedbyHPLC.Resultsindicatedthat,sevenkindsofCoprinusfungishowedsignificantnematicidalactivity,andthenematicidalactivitywaspositivelyrelatedtodistributionofnematotoxin.

Coprinus;nematicidalactivity;nematotoxin

国家自然科学基金资助项目(30860009，31260446)

2016-11-22

丁正蛟(1992-)，男，云南曲靖人，硕士研究生，研究方向：植物保护，E-mail:526543777@qq.com；通讯作者：刘亚君，副研究员，E-mail:lyj@ynu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.04.005

Q939

A

1672-5425(2017)04-0019-02

丁正蛟，孟帅，刘亚君.鬼伞属真菌的杀线虫活性[J].化学与生物工程，2017，34(4)：19-20，27.