新疆阿魏菇细菌性斑点病病原菌的鉴定

罗影，关永强，贾培松，努尔孜亚·亚力买买提，郝敬喆，贾文捷，魏鹏

(1. 农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室/新疆农业科学院植物保护研究所，乌鲁木齐 830091；2.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，乌鲁木齐 830002)

新疆阿魏菇细菌性斑点病病原菌的鉴定

罗影1，关永强2，贾培松1，努尔孜亚·亚力买买提1，郝敬喆1，贾文捷1，魏鹏1

(1. 农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室/新疆农业科学院植物保护研究所，乌鲁木齐 830091；2.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，乌鲁木齐 830002)

【目的】研究新疆地区阿魏菇细菌性斑点病的病原菌。【方法】应用菌落特征、致病性测定、16S rDNA序列测定、序列同源性比较，及生理生化反应特征，对阿魏菇细菌性斑点病病原菌分离物进行鉴定。【结果】从阿魏菇子实体病害样品中分离到19个单菌落分离物，并对该19个分离物进行致病性检测，其中有8个分离物在健康阿魏菇子实体上产生了细菌性斑点病症状，通过16S rDNA序列比对、序列同源性比较和生理生化反应分析，该8个分离物均为假单胞杆菌(Pseudomonasspp.)。【结论】新疆地区阿魏菇细菌斑点病由假单胞杆菌 (Pseudomonasspp.)引起。

阿魏菇；细菌性斑点病；形态学鉴定；分子生物学鉴定；假单胞杆菌

0 引 言

【研究意义】阿魏菇(Pleurotus. Eryngii var. ferulae)又名阿魏侧耳、阿魏蘑、西天白灵芝等，具有优良的食用和药用价值，是新疆地区特有的一种珍稀食用菌资源[1]。细菌性斑点病(Bacterial spot disease)又称细菌性褐斑病、锈斑病，是一种发生在菌盖表面的细菌性斑点病，主要表现为发生在菌盖表面不规则和褐色斑点，有时也表现为褐色凹陷斑。其危害性极大，一旦发生，传播迅速，很难彻底防治，并且会逐年加重[2]，给菇农造成严重的经济损失。主要危害平菇和双孢蘑菇，在杏鲍菇、香菇、金针菇等食用菌上也有报道[3]，而关于阿魏菇细菌性斑点病的报道很少。因此，研究阿魏菇细菌斑点病的发病原因及病原菌鉴定，对开发利用阿魏菇种质资源和研发抗性菌种都具有重要的意义。【前人研究进展】近年来随着新疆阿魏菇栽培规模不断扩大，褐斑病的发病率及发病程度越来越严重，如努尔孜亚等[4]于2011年4～6月在新疆的哈巴河县、乌鲁木齐县南山板房沟乡等地的菇棚内调查发现在平菇和阿魏菇上都相继出现了细菌性斑点性病变，但并没有理想的防治措施；张瑞颖[2]和金丹[5]采用16s rDNA序列测定及序列同源性比较的方法，均鉴定出了平菇褐斑病病原菌为托拉斯假单胞杆菌(Pseudomonastolaasii)，表明采用16S rDNA序列分析方法鉴定食用菌致病病原菌的可行性。【本研究切入点】有关新疆地区阿魏菇细菌性褐斑病病原菌分类及鉴定的研究未见文献报道。研究通过病原菌16S rDNA序列测定以及序列同源性比较，结合病原菌落特征、菌体形态观察和革兰氏染色反应等方法，对引起新疆地区阿魏菇细菌斑点病的病原菌进行分类鉴定。【拟解决的关键问题】研究鉴定出的致病病原菌的种属关系，为阿魏菇在实际生产中的病害防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

患病的阿魏菇子实体分别采自乌鲁木齐县板房沟和阿勒泰地区青河县，致病性测定所用健康子实体购自乌鲁木齐市北园春市场。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分离纯化

采用常规分离方法进行[2]，先用75%酒精对病菇表面消毒，再用无菌水冲洗2～3次，置于无菌玻璃皿中，于病健交界处取约5 mm2病斑组织3～5块，同一病斑的病斑组织块置于同一LB平板中。平板置于25℃恒温培养箱内培养，每天观察病菌生长情况，2～3 d后观察菌落生长情况，并纯化保存。

1.2.2 致病性测定

致病性检测常采用点蚀测试评估方法(spotting-test)[6]，即将细菌菌悬液接种到健康蘑菇菌盖表面，观察是否形成侵染抑制病斑。以健康的阿魏菇子实体作为病原菌致病性检测的供试材料，挑取单菌落于LB液体培养基中振荡培养16～18 h，取健康阿魏菇子实体，表面用75%酒精消毒，以雾状喷洒在阿魏菇子实体上，以无菌水作对照试验，每组设3个重复，放入铺有保湿纸的塑料盒内，于恒温培养箱25℃培养观察。

1.2.3 分子生物学鉴定

待测分离物在LB液体培养基培养24 h，用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取分离物的细菌总DNA。利用细菌16S rDNA的通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1 492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增。PCR反应体系(50 μL)：引物27F和1 492R各1 μL，Taq酶1 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs(10 mmol/L)1 μL，MgCl2(25 mmol/L)3 μL，DNA模板2 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30s，72℃延长1 min，35个循环，72℃10 min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，用纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)进行纯化。

将纯化后的产物交由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司进行测序。测序结果利用DNAstar软件进行拼接，后提交至NCBI核酸数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/)，进行BLAST比对分析。分别选取与各个菌株相似性较高的细菌16S rDNA序列，进行系统进化分析，利用MEGA6.0软件首先进行多重序列比对，再采用Neighbour-joining法构建系统发育树，进行1 000次Bootstrap自举法检验[5]。

1.2.4 形态学鉴定

参照东秀珠等[7]编著的《常见细菌系统鉴定手册》中的方法进行，对各菌株的生长温度、接触酶、氧化酶等生理生化特征进行测定，并依照《伯杰细菌鉴定手册》[8]进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 患病子实体的症状

研究表明，细菌性斑点病在阿魏菇生长的任何时期都有发现，且病原菌一般侵染阿魏菇子实体的表面组织，多为菌盖被感染。如果在子实体早期发育阶段感染病原菌，会导致子实体发育缓慢或畸形，甚至停止发育，子实体萎蔫死亡。成熟子实体被侵染后，菌盖表面病斑或呈点状或块状分布，呈现圆形或近圆形黄褐色凹陷斑；或呈片状分布，条件适宜时病斑蔓延至整个子实体，且凹陷斑表面会出现一层粘性菌脓，并迅速腐烂发出臭味，严重影响阿魏菇的产量。若及时菇棚内控制温度和湿度，可有效控制患病的范围和程度，但已产生的病斑不会消散，影响阿魏菇的品质。图1

图1 阿魏菇细菌性斑点病的症状
Fig.1 Disease symptoms of thePleurotus. Eryngii var. ferulae

2.2 病原菌的分离纯化与致病性检测

在新疆阿魏菇主栽区乌鲁木齐县和青河县共计采集阿魏菇病样14个，分离出19个单菌落。分别将该19个分离物回接至健康的阿魏菇子实体，引起病斑反应，即有致病性的分离物有8个：BD2、BD3、BD13、BD14、BD15、BD18、BD19和BD20。人工感染的阿魏菇子实体，约48 h后出现病斑，72 h后整个子实体开始发臭发粘，与大田发病症状基本相同，而阴性对照无明显反应，且从再次接种后发病子实体上分离到与接种菌株菌落形态相同的菌株。表1

表1 菌株来源、菌落形态及致病性检测
Table 1 Origin of stains, colony morphologies and pathogenecitiestest

采集病样Samples纯化菌株Purifiedstrains来源Origin菌落形态特征Colonymorphologies致病性检测PathogenecitytestAW-1BD1青河县淡黄色,圆形,边缘整齐,表面光滑,隆起,有光泽-AW-2BD2青河县乳白色,圆形,边缘整齐,表面光滑,隆起,有光泽+AW-3BD3青河县乳白色,圆形,边缘整齐,表面光滑,隆起,有光泽+AW-4BD4乌鲁木齐县乳白色,不规则形状,边缘不整齐,表面粗糙,无光泽-AW-4BD5乌鲁木齐县乳白色,不规则形状,边缘不整齐,表面粗糙,无光泽-AW-5BD6乌鲁木齐县黄色,圆形,边缘整齐,表面光滑,隆起,有光泽-AW-5BD7乌鲁木齐县乳白色,圆形,边缘整齐,表面光滑,隆起,有光泽-AW-6BD8乌鲁木齐县乳白色,圆形,边缘整齐,表面光滑,隆起,有光泽+AW-7BD10乌鲁木齐县乳白色,不规则形状,边缘不整齐,表面粗糙,无光泽-SF-1BD11乌鲁木齐县乳白色,圆形,边缘整齐,表面粗糙,无光泽-SF-2BD12乌鲁木齐县白色,圆形,边缘整齐,表面光滑,隆起,有光泽-SF-3BD13乌鲁木齐县乳白色,圆形,边缘整齐,表面光滑,隆起,有光泽+AW-11BD14青河县乳白色,圆形,边缘整齐,表面光滑,隆起,有光泽+AW-12BD15青河县乳白色,圆形,边缘整齐,表面光滑,隆起,有光泽+AW-12BD16青河县乳白色,圆形,边缘整齐,表面光滑,隆起,有光泽-AW-13BD17青河县乳白色,圆形,边缘整齐,表面光滑,隆起,有光泽-AW-13BD18青河县乳白色,圆形,边缘整齐,表面光滑,隆起,有光泽+AW-14BD19青河县乳白色,圆形,边缘整齐,表面光滑,隆起,有光泽+AW-14BD20青河县乳白色,圆形,边缘整齐,表面光滑,隆起,有光泽+

注："+"有致病性，"-"无致病性

Note: "+" Pathogenicity, "-" No pathogenicity

2.3 分子生物学鉴定

提取8个分离物的全基因组DNA，用16S rDNA基因通用引物27F/1492R扩增8个分离物的基因组DNA，电泳检测其分子量均约为1 500 bp，其分子量大小与理论值相符。基因测序后，分别将8个分离物的16S rDNA序列在NCBI上进行Blast比对分析，研究表明，与这8个分离物同源性高达99%的均属于假单胞杆菌属(Pseudomonas)。 图2

选择这些种属关系较明确的菌株，并从LPSN(www.bacterio.net/bacillus.html)上下载该菌的模式菌株的16S rDNA序列，与8个分离物的16S rDNA序列一起，用Mega6.0中Neighbor-joining 法进行1 000次Bootstrap自举法检验构建系统发育树。8个分离物BD2、BD3、BD13、BD14、BD15、BD18、BD19和BD20可确定为Pseudomonassp.；且BD3和BD20、BD14和BD19的进化距离很小，且自举值>50%，这说明它们可能为同一种菌或亲缘关系较近。 图3

图2 8个分离物的16S rDNA基因扩增结果
Fig.2 PCR amplification of 16S rDNA of 8 pathogenic bacteria

图3 基于16S rDNA序列的系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence表2 8个分离物的生理生化特征
Table 2 Physiological and biochemical characteristics of 10 pathogenic bacteria

项目Items菌株 StrainsBD2BD3BD13BD14BD15BD18BD19BD20革兰氏染色(Gramstain)--------乙醇产酸(Useofethanoltoaceticacid)--------D-甘露醇产酸(UseofD-mannitoltoacid)--------反硝化(Denitrification)--------氧化酶(Oxidase)++++++++接触酶(Hydrogenperoxidase)++++++++硝酸盐还原(Nitratereduction)++++++++甲基红测定(Methylredtest)--------V-P测定(Voges-Proskauer)--------吲哚(Indole)--------明胶液化(Gelatinliquefaction)++++++++丙二酸利用(Useofmalonate)++++++++淀粉水解(Starchhydrolysis)--------赖氨酸脱羧酶(Lysinedecarboxylase)--------鸟氨酸脱羧酶(Ornithinedecarboxylase)--------苯丙氨酸脱氨酶(Phenylalaninedeamination)--------精氨酸双水解酶(Argininedihydrolase)++++++++生长:4℃(4℃tolerance)++++++++41℃(41℃tolerance)----++--60℃(60℃tolerance)--------

注：“+/-”分别表示生理生化反应的阳性和阴性

Note: "+/-" indicates positive and negative of these physiological and biochemical tests, respectively

2.4 形态学鉴定

研究表明，8个分离物均为革兰氏阴性菌，均不能在60℃下生长，不能氧化乙醇和甘露醇产酸，不能进行反硝化作用，能够产生氧化酶和接触酶，能够还原硝酸盐，甲基红和V-P测定皆为阴性，不产生吲哚等特征，均符合《伯杰细菌鉴定手册》[7]中好氧革兰氏阴性杆菌检索表中对假单胞菌属的检索。表2

3 讨 论

彭炜等报道侵染性细菌病害的病原菌主要为假单胞杆菌属(Pseudomonas)和欧文氏菌属(Erwinia)，而侵染性细菌病害主要为细菌性褐斑病[9]。回接病原菌的阿魏菇子实体，初期为小的黄褐色的斑点，逐步发展成为大片黄褐色斑块，最后整个菇体腐烂变质。其菌落形态大多为米白色，圆形，边缘整齐，光滑，饱满，有光泽。经检测8株菌均为革兰氏阴性菌，氧化酶和接触酶反应均呈阳性甲基红和V-P反应呈阴性。根据菌落形态、革兰氏染色法与16S rDNA序列测定以及序列同源性比较得出致病菌菌株BD2、BD3、BD13、BD14、BD15、BD18、BD19和BD20均属于假单胞杆菌属 (Pseudomonas )，但无法确定具体种。据调查，未见有新疆地区阿魏菇致病性病原菌的分析鉴定的相关报道，研究首次确定出新疆地区阿魏菇致病性病原菌为假单胞杆菌(Pseudomonasspp.)。

根据1993年Palleroni对假单胞菌属的分类[10]，假单胞菌属包括20个种59个致病变种，而事实上该属成员众多，是一个异质性很强的属。研究得出8株致病病原菌均属于假单胞杆菌属(Pseudomonas)，而可能为不同种。针对阿魏菇致病性病原菌分类，开展更深层次的研究，获得更为详细的分类标准，为阿魏菇细菌性斑点病的科学防治提供依据，将是该领域未来研究的重点。

4 结 论

从新疆阿魏菇主栽区乌鲁木齐县和青河县采集阿魏菇细菌性斑点病病菇，分离到细菌性分离物，经致病性测定、形态学鉴定包括其各类生理生化反应和分子生物学辅助(16S rDNA序列比对和同源性比较)鉴定出病原菌为假单胞杆菌(Pseudomonasspp.)。病原菌的确定为阿魏菇在实际生产中的病害防控提供了理论依据。

References)

[1] 戴玉成,周丽伟,杨祝良,等.中国食用菌名录[J].菌物学报, 2010, (29): 1-21.

DAI Yu-cheng, ZHOU Li-wei, YANG Zhu-liang, et al. (2010). A revised checklist of edible fungi in China [J].Mycosystema, (29): (1): 1-21.

[2] 张瑞颖,左雪梅,姜瑞波,等.平菇褐斑病病原菌的分离与鉴定[J].中国食用菌,2007,26(5): 58-60.

ZHANG Rui-ying, ZUO Xue-mei, JIANG Rui-bo, et al. (2007). Isolation and Identification of Pathogenic Bacteria Caused Brown Blotch Disease of Oyster mushroom [J].EdibleFungiofChina, 26(5): 58-60. (in Chinese)

[3] 张瑞颖,胡丹丹,左雪梅,等.平菇和双孢菇细菌性褐斑病研究进展[J].植物保护学报,2007,34(5): 549-554.

ZHANG Rui-ying, HU Dan-dan, ZUO Xue-mei, et al. (2007). Research advancement on brown blotch disease of oyster mushroom and button mushroom [J].ActaPhytophylacicaSinica, 34(5): 549-554. (in Chinese)

[4] 努尔孜亚,郝敬喆,魏鹏,等.北疆地区食用菌细菌性褐斑病诊断与防治药剂筛选[J].新疆农业科学,2012,49(12):2 234-2 238.

Nuerziya, HAO Jing-zhe,WEI Peng, et al. (2012). Occurrence and Identification of Bacterial Brown Patch of Processing Mushrooms in Nortnern Xinjiang [J].XinjiangAgriculturalSciences, 49(12): 2,234-2238. (in Chinese)

[5] 金丹,李宝聚,石延霞,等.一种平菇褐斑病病原菌的鉴定[J].食用菌学报,2009,16(1):89-91.

JIN Dan, LI Bao-ju, SHI Yan-xia, et al. (2009). Identification of a pathogenic bacteria caused brown blotch disease of oyster mushroom [J].ActaEdulisFungi, 16(1): 89-91. (in Chinese)

[6] Yun, Y. B., Park, S. W., Cha, J. S., & Kim, Y. K. (2013). Biological characterization of various strains of pseudomonas tolaasii, that causes brown blotch disease.AppliedBiologicalChemistry, 56(1):41-45.

[7] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[K].北京：科学出版社,2001: 353-398.

DONG Xiu-zhu, CAI Miao-ying. (2001).Handbookofcommonbacterialsystemidentification[K]. Beijing: Science Press: 353-398. (in Chinese)

[8] R.E.布坎南,N.E.吉本斯,等. 伯杰细菌鉴定手册(第八版) [K].北京：科学出版社,1984:128-171.

R.E.Buchanan, N.E. Gibbons, et al. (1984).Bergey'smanualofsystematicbacteriology[K]. Beijing: Science Press: 128-171. (in Chinese)

[9] 王晶.食用菌病害的调查与新病害病原菌鉴定研究[D]. 沈阳: 沈阳农业大学硕士论文,2010.

WANG Jing. (2010).Thesurveyofthemushroomdiseasesandtheidentificationofnewoccurringdiseasespathogens[D]. Master Dissertation. Shenyang Agricultural University，Shenyang. (in Chinese)

[10] 郭亚辉,郭坚华,李斌.根据16S rRNA序列对假单胞菌属分类学的研究进展[J].微生物学杂志,2004,24(2):38-41.

GUO Ya-hui, GUO Jian-hua, LI Bin. (2004). Advance of Taxon of Pseudomonas Based on 16S rRNA Sequence [J].JournalofMicrobiology, 24(2):38-41. (in Chinese)

Supported by: China Agriculture Research System Program (No.CARS24)；Open Fund of Key Laboratory of Integrated Management of Harmful Crop Vermin in China North-western Desert Oasis "The investigation and identification of bacterial spot disease and pathogen on Pleurotus ferulae in Xinjiang" (No.KFJJ20150105)

WEI Peng(1961-), male, Edible fungi cultivation research

Identification of Pathogens Causing Bacterial Spot Disease onPleurotusFerulae (Pleurotus. Eryngii var. ferulae) in Xinjiang

LUO Ying1，GUAN Yong-qiang2，JIA Pei-song1，Nerziya Yalimaimaiti1， HAO Jing-zhe1，JIA Wen-jie1，WEI Peng1

(1.KeyLaboratoryofIntegratedManagementofHarmfulCropVermininChinaNorth-westernOasis,MinistryofAgriculture,P.R.China/ResearchInstituteofPlantProtection,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China; 2.XinjiangResearchInstitutesofTraditionalChineseMateriaMedicaandEthnodrug,Urumqi830002,China)

【Objective】 The objective of this study is to identify the pathogens that cause bacterial spot disease ofPleurotusferulae in Xinjiang. 【Method】The causal agents were identified by colony characterization, pathogenicity test, 16S rDNA sequence analyses, sequence homology comparison, and biochemical characterization tests. 【Result】Nineteen bacterial isolates were isolated from diseased samples ofPleurotusferulae. Through pathogenicity test, eight tested isolates caused typical symptoms of bacterial spot disease on the healthy fruiting bodies ofPleurotusferulae. Based on pathogenicity test, and combined with the results of 16S rDNA sequence analyses, sequence homology comparison, biochemical and molecular characterization, eight isolates were identified asPseudomonasspp. 【Conclusion】The bacterial spot disease onPleurotusferulae in Xinjiang is incited byPseudomonasspp.

Pleurotus. eryngii var. ferulae; bacterial spot disease; morphological identification; molecular biological identification;Pseudomonas

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.03.016

2016-11-24

国家现代农业产业技术体系项目(CARS24)；农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室开放基金“新疆阿魏菇细菌性斑点病的调查与病原菌鉴定研究”(KFJJ20150105)

罗影(1988-)，女，硕士研究生，助理研究员，研究方向为食用菌育种，(E-mail)ly19880219@126.com

魏鹏(1961-)，男，新疆人，高级农艺师，研究方向为食用菌栽培，(E-mail)xjzbswp@126.com

S435.673

A

1001-4330(2017)03-0513-07