丽水市严重急性呼吸道感染病毒多重检测的调查分析

王晓光+雷永良++叶碧峰++叶灵++刘敏

[摘要] 目的 了解本市嚴重急性呼吸道病毒病原谱的构成情况，以期能够为临床用药提供病原学数据。 方法 采用基于DPO技术的多重RT-PCR方法同时检测呼吸道感染13种病毒：人呼吸道合胞病毒（RSV），人鼻病毒（hRV），呼吸道腺病毒（AdV），人肠道病毒（hEV），人偏肺病毒（hMPV），人冠状病毒（hCoV 229E/OC43），人博卡病毒（hBoV），甲、乙型流行性感冒病毒（Inf A and Inf B），副流感病毒（PIV 1/2/3），凝胶电泳鉴定结果。 结果 累计761份严重急性呼吸道感染患者标本中，共检出病毒阳性标本214份，阳性率为28.12%。除PIV 2和hCoV 229E未检出外，其他11种病原均有被检出，检出率为32.19%，前三位分别是RSV 55份、hRV 45份、Inf B 36份。共有27份病原混合感染标本，其中23份双重感染，4份三重感染，混合感染前三位分别是 hRV 18份、RSV 13份和PIV 3 7份。 结论 丽水市严重急性呼吸道病毒感染的主要病原体是RSV，除流感病毒外hRV、hMPV、PIV 3、hEV亦为主要单一致病原，hRV、RSV较高的混合感染率提示hRV或RSV的多重感染可能是呼吸道的基础感染。

[关键词] 病毒；呼吸道感染；多重感染；基因；多重PCR

[中图分类号] R56 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）04-0125-03

Investigation and analysis of multiple detection of severe acute respiratory tract infection virus in Lishui City

WANG Xiaoguang LEI Yongliang YE Bifeng YE Ling LIU Min

Lishui Disease Control and Prevention Center in Zhejiang Province， Lishui 323000， China

[Abstract] Objective To understand the composition of pathogenic spectrum of severe acute respiratory virus（SARS） in our city， so as to provide etiological data for clinical drug use. Methods Multiple RT-PCR method based on DPO technique was used to detect 13 viruses of respiratory tract infection simultaneously： human respiratory syncytial virus（RSV）， human rhinovirus（hRV）， respiratory adenovirus（AdV）， human enterovirus（hEV）， human metapneumovirus（hMPV）， human coronavirus（hCoV 229E/OC43）， human bocavirus（hBoV）， influenza A and B virus（Inf A and Inf B）， and parainfluenza virus（PIV 1/2/3）. Gel electrophoresis was used to identify the results. Results A total of 214 SARS-positive samples were detected from 761 patient samples with severe acute respiratory infection， and the positive rate was 28.12%. In addition to PIV 2 and hCoV 229E which were not detected， the other 11 pathogens were detected， with the detection rate of 32.19%. The first three were RSV in 55 samples， hRV in 45 samples， and Inf B in 36 samples. There were a total of 27 pathogenic mixed infection samples， with double infection in 23 samples， and triple infection in 4 samples. The first three viruses of mixed infections were hRV in 18 samples， RSV in 13 samples and PIV 3 in 7 samples. Conclusion The main pathogens of severe acute respiratory virus infection in Lishui city are RSV. In addition to influenza virus， hRV， hMPV， PIV 3， and hEV are also the main single pathogens. The higher mixed infection rate of hRV and RSV suggests the multiple infections of hRV or RSV may be the basis of the respiratory tract infection.

[Key words] Virus； Respiratory infection； Multiple infection； Gene； Multiple PCR

临床上急性呼吸道感染较为多见，不仅出现发热与呼吸系统疾病的症状和体征，而且可导致或伴随产生全身及其他组织系统疾病等多种临床表现，其病原学相对较复杂，其中80%以上是病毒性的，目前已知至少有8科200种不同亚型的病毒可以通过呼吸道侵害人体[1-3]。常见的可侵害呼吸道造成临床感染的病毒有人呼吸道合胞病毒（RSV），人鼻病毒（hRV），呼吸道腺病毒（AdV），人肠道病毒（hEV），人偏肺病毒（hMPV），人冠状病毒（hCoV 229E/OC43），人博卡病毒（hBoV），甲、乙型流行性感冒病毒（Inf A and Inf B），副流感病毒（PIV 1/2/3）等[2-7]。为了解本市严重急性呼吸道病毒病原谱的构成情况，本文采用可以有效降低非特异扩增产物生成和引物二聚体产生的双启动寡核苷酸引物技术（dual priming oligonucleotide，DPO）的高通量多重RT-PCR方法[8，9]检测上述13种呼吸道病毒，以期能够为临床用药提供病原学数据。

1 资料与方法

1.1 标本来源

收集2012年1月～2015年12月丽水市中心医院儿科病房、呼吸内科和ICU符合中国CDC《住院严重急性呼吸道感染病例哨点监测方案（2011年版）》[10]感染病例定义患者的上呼吸道标本：起病急，体温≥38℃，咳嗽或者伴有咽部疼痛，呼吸困难（呼吸频率≥25次/min）。5岁（含）以下的婴幼儿具备至少下述3项临床表现也视为严重急性呼吸道感染病例：（1）起病急；（2）咳嗽或者呼吸困难；（3）同时有以下体征或症状中的1项：气促、拒食、呕吐、抽搐、昏迷/嗜睡、喘鸣/胸壁凹陷。

1.2 标本采集与前处理

每日筛查出符合病例定义的患者，在出现急性呼吸道感染症状后24 h内采集患者的鼻咽拭子（使用含聚丙烯纤维的拭子，不能使用棉拭子），尽量在药物使用前采集标本。采好样的鼻咽拭子折断尾部随即放入含有病毒保存液的采样试管内，旋紧螺旋管盖，放入4℃暂时冷藏保存。哨点医院标本及时冷链送至网络实验室进行检测，实验室收到后立即处理，将标本置于振荡器上充分振荡后拧开盖子反复挤压拭子，放置于4℃自然沉淀后取2 mL上清液备用[10]。

1.3 多重RT-PCR检测

抽提病毒基因组核酸使用MagNA Prue Total Nucleic Acid Kit（Roche，REF：11 858 874 001）；高通量多重RT-PCR采用DiaPlexCTM RV13 Detection Kit（Solgent，REF：SMD50-K100）检测呼吸道感染13种病毒：RSV、hRV、AdV、hEV、hMPV、hCoV 229E/OC43、hBoV、Inf A、Inf B、PIV 1/2/3；3%琼脂糖（OXOID）凝胶电泳鉴定结果。核酸抽提、PCR反应体系、反应参数及具体操作参照试剂盒说明书。

1.4 统计学处理

将相关数据录入Excel 2010和SPSS 18.0统计学软件进行统计分析和评价。

2 结果

2.1 核酸凝胶电泳结果

累计收到哨点医院2012年1月～2015年12月761份严重急性呼吸道感染患者呼吸道标本（编号：33110541～33111217、S15193001～S15193084），标本核酸扩增产物、PCR质控凝胶电泳判定后获得理想的预期目的病原特异性基因扩增片段，而阴性对照未见非特异性扩增条带（封三图9）。

2.2 病原检测结果

761份患者标本中经多重PCR共检出阳性标本214份，阳性率为28.12%（214/761）。除PIV 2和hCoV 229E未检出外，其他11种总计245个病原均被检出，检出率为32.19%（245/761），前三位分别是RSV 55份、hRV 45份、Inf B 36份，是最主要的優势病原，其次为Inf A、hMPV、PIV 3（表1）。

同时检出有2种以上病原混合感染标本27份，混感率为7.62%，其中23份双重感染，检出率为6.04%（46/761）；4份三重感染，检出率为1.58%（12/761），混合感染前三位分别是 hRV（18份）、RSV（13份）和PIV 3（7份）（表1）。

3 讨论

以呼吸道感染为主要临床症状的急性传染病通常多发生在气候突变的冬春季节，在免疫力较为低下的人群中如婴幼儿、老年人、气管插管患者其发病率往往存在周期性升高的现象。目前针对呼吸道感染病例的病原谱构成特征研究发现除流行性感冒病毒外，RSV、AdV、hRV等其他传染性较强的病原体经常会在群体生活、集中居住的人群中广泛传播，造成小范围内的暴发和流行，是国内免疫力低下人群发病和住院就医的重要原因之一[11-13]。因此了解本地区急性呼吸道病毒病原谱构成及病原特征，预期能够提供呼吸道病毒流行病学的研究线索；准确快速的实验室病原检测可早期协助诊断、识别特定感染，具有重要的临床价值。

RSV是婴幼儿急性下呼吸道感染的最常见病原，5岁以内因急性呼吸道感染住院的患儿中有20%与RSV感染有关，同时也会在大龄儿童及成人中导致轻微或严重的呼吸道疾病[3]。丽水市严重急性呼吸道病毒感染的主要病原体是RSV，与以往报道的在浙江沿海[14]、温州[15]、湖州[16]、永康[17]等地引起呼吸道感染的病原体以RSV为首的检测结果相符，RSV感染是我市冬春季婴幼儿住院的主要原因之一。但是甲、乙型流感病毒仍然是检出最多的病原，而RSV与流感的流行特征相似，每年集中在冬春季节出现并且流行高峰单一。本研究临床样本一年四季均衡采集，提示流感病毒和RSV是导致我市每年冬春季急性呼吸道感染住院病例增加的主要病原体。此外hRV、hMPV、PIV 3、hEV亦为主要单一致病原，与我省其他地区[14-17]报道的病原谱构成有所不同，可能与某些病毒具有间隔性的流行特征、在特定范围内有些病毒出现短暂性的局部爆发等原因导致呼吸道感染病原谱系的多样性有着直接的关系。

相对于以往单独检测病原体，我们采用基于DPO技术的多重RT-PCR方法检测呼吸道感染13种常见病毒，使得容易產生非特异扩增产物和引物二聚体以及多重引物间相互干扰等问题得以解决[8，9]。我市严重急性呼吸道感染患者多重感染为7.62%，宋斌等[14]用直接免疫荧光法检测7种病毒的多重感染率为3.4%，叶楚楚[18]、赵勤英[16]、石伟先[19]、于德山[20]等用其他多重方法检测12种常见病毒的多重感染率分别为4.68%、13.64%、17.08%和29.35%，因此采用不同的检测方法可直接导致多重感染率出现差异，DPO引物多重检测方法能更全面、准确、有效地反映出呼吸道感染症候群体中病原谱系的原始分布情况，发现各类病原体感染的主要占比和排序，真实有效地检出多重感染。多重感染在人体内可能形成较为复杂的致病机制，有隐性携带者感染多种其他病毒发病也可能发展为一种常态，所采用的检测方法差异最终可能导致广泛低估多重感染率[3]。丽水市hRV、RSV较高的多重感染率提示hRV或RSV的多重感染可能是呼吸道的基础感染，而并非是其致病原因，因此在临床上需要综合考虑复合感染的可能性，需要明确界定真正导致感染的病毒种类。

依托此技术我们已经建立起以实验室分子鉴定为基础的急性呼吸道病毒感染多重快速检测技术平台，具有同时检出多种呼吸道病毒的优势，既可用于临床实验室常规呼吸道感染的检测，也可用于重大呼吸道病毒暴发时的检测。不同的病毒感染可能表现出相似的临床体征，而不同的抗病毒药物有着独自的抗病毒谱，在临床治疗选择抗病毒药物时需针对特定病毒选择特异性药物，因此实验室准确快速地检出混感病毒并界定致病的病毒种类具有重要的临床参考价值，对开展特异性病原治疗、减少盲目的抗生素使用、减少住院时间以及降低医疗费用等有重要意义。

[参考文献]

[1] Mahony JB.Detection of respiratory viruses by molecular methods[J].Clin Microbiol Rev，2008，21（4）：716-747.

[2] Brittain-Long R，Nord S，Olofsson S，et al.Multiplex real-time PCR for detection of respiratory tract infections[J].J Clin Virol，2008，41（1）：53-56.

[3] 张国翠.多重PCR方法研究儿童呼吸道感染病毒谱系特征[D].重庆医科大学，2011.

[4] Kesson AM.Respiratory virus infections[J]. Paediatric Respiratory Reviews，2007，8（3）：240-248.

[5] Kim SR，Ki CS，Lee NY.Rapid detection and identification of 12 respiratory viruses using a dual priming oligonucleotide system-based multiplex PCR assay[J].J Virol Methods，2009，156（1-2）：111-116.

[6] Wang W，Ren P，Sheng J，et al.Simultaneous detection of respiratory viruses in children with acute respiratory infection using two different multiplex reverse transcription-PCR assays[J].J Virol Methods，2009，162（1-2）：40-45.

[7] Lassauniere R，Kresfelder T，Venter M.A novel multiplex real-time RT-PCR assay with FRET hybridization probes for the detection and quantitation of 13 respiratory viruses[J].J Virol Methods，2010，165（2）：254-260.

[8] Yoo SJ，Kuak EY，Shin BM.Detection of 12 respiratory viruses with two-set multiplex reverse transcriptase-PCR assay using a dual priming oligonucleotide system[J].Korean J Lab Med，2007，27（6）：420-427.

[9] Kao CC，Liu MF，Lin CF，et al.Antimicrobial susceptibility and multiplex PCR screening of AmpC genes from isolates of enterobacter cloacae，citrobacter freundii，and serratia marcescens[J].J Microbiol Immunol Infect，2010，43（3）：180-187.

[10] 中国中央人民政府.关于印发《住院严重急性呼吸道感染病例哨点监测方案（2011年版）》的通知[EB/OL] [2011-02-11].http：//www.gov.cn/zwgk/2011-02/11/content_1801649.htm.

[11] Rodríguez-Martínez CE，Rodríguez DA，Nino G.Respiratory syncytial virus， adenoviruses， and mixed acute lower respiratory infections in children in a developing country[J].J Med Virol，2015，87（5）：774-781.

[12] Li H，Wei Q，Tan A，et al.Epidemiological analysis of respiratory viral etiology for influenza-like illness during 2010 in Zhuhai，China[J].Virol J，2013，10（5）：143.

[13] 王坤，李宏，张淑艳，等.急性呼吸道感染病毒性病原种类及主要特征[J].灾害医学与救援（电子版），2016，5（2）：120-123.

[14] 宋斌，朱立军，黄其俊.浙江沿海地区急性下呼吸道感染患儿的病毒病原检测分析[J]. 放射免疫学杂志，2012，25（2）：211-212.

[15] 周晓聪，徐强，董琳，等.儿童呼吸道病毒感染谱临床分析[J].浙江医学，2006，28（4）：293-294.

[16] 赵勤英，徐德顺，金文君.110例儿童急性呼吸道感染病毒病原学调查[J].浙江预防医学，2011，23（6）：76-78.

[17] 郑国阳，陈冰蓉.永康市1个月～12岁下呼吸道感染患儿的病毒病原现状及不同年龄、季节、病种的病毒检出情况比较[J].中国地方病防治杂志，2016，31（2）：137-140.

[18] 叶楚楚，朱渭萍，王远萍，等.上海市浦东新区363例老年流感样病例及严重呼吸道感染病例病毒病原谱特征分析[J].上海预防医学，2016，28（11）：772-776.

[19] 石伟先，彭晓旻，韩莉莉，等.北京地区儿童急性上呼吸道感染病毒病原学调查[J].中国卫生检验杂志，2008， 18（7）：1263-1265.

[20] 于德山，李红育，姜中毅，等.兰州地区严重急性呼吸道感染住院病例病原谱研究[J].中国病毒病杂志，2012，2（1）：42-46.

（收稿日期：2016-11-12）