血清游离脂肪酸和尿足细胞标志蛋白检测在2型糖尿病肾病中的诊断价值

刘倩，杨伏猛，赵绍林，郑萍，朱伟

(1.江苏大学医学院，江苏镇江 212013；2.连云港市第二人民医院检验科，江苏连云港 222006；3.连云港市第一人民医院检验科，江苏连云港 222006)

血清游离脂肪酸和尿足细胞标志蛋白检测在2型糖尿病肾病中的诊断价值

刘倩1,2，杨伏猛2，赵绍林3，郑萍3，朱伟1

(1.江苏大学医学院，江苏镇江 212013；2.连云港市第二人民医院检验科，江苏连云港 222006；3.连云港市第一人民医院检验科，江苏连云港 222006)

目的 探讨血清游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)及尿足细胞标志蛋白(podocalyxin, PCX)在2型糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)中的诊断价值。方法 选取120例2型糖尿病患者，依据尿清蛋白/尿肌酐比值(urinary albumin-creatinine ratio, UACR)将患者分为正常清蛋白尿组(NA)、微量清蛋白尿组(MA)和大量清蛋白尿(LA)3组；选取同期体检健康者40例作为对照组。检测各组血清FFA和尿PCX水平并进行相关性分析，采用ROC曲线评估其对DN的诊断价值。结果 NA组、MA组、LA组以及健康人对照组血清FFA检测结果分别为(0.61±0.14)、(0.81±0.13)、(0.95±0.18)和(0.49±0.11) mmol/L，尿PCX检测结果分别为(1.86±0.45)、(4.47±1.48)、(6.72±1.40)和(1.38±0.24) ng/mL，糖尿病患者血清FFA和尿PCX均高于健康人对照组，差异有统计学意义(P均<0.05)，并随着疾病进展而升高。Pearson相关分析显示，血清FFA与尿PCX呈正相关(r=0.73,P<0.05)。血清FFA和尿PCX单独检测诊断DN的敏感性分别为 74.1%和80.6%，联合检测的敏感性为89.5%(P<0.05)。结论 2型糖尿病患者肾损伤时血清FFA和PCX明显升高，两者对于DN诊断具有重要的临床价值。

糖尿病肾病；游离脂肪酸；足细胞标志蛋白

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是2型糖尿病慢性微血管病变的严重并发症之一，是糖尿病患者致残、致死的重要原因[1]，由于其病程呈现不可逆的进展，对患者的生活质量和预后造成严重的影响。目前，关于DN发病机制尚未阐明，但如果能够在DN早期作出诊断，并及时进行有效干预，将具有重要的临床意义。本研究旨在检测2型糖尿病患者血清游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)和尿足细胞标志蛋白(podocalyxin,PCX)表达水平，分析其对DN诊断价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2015年6月至2016年5月于连云港市第二人民医院内分泌科就诊且依据2016年美国糖尿病协会(ADA)制定的糖尿病诊断和分型标准[2]确诊为2型糖尿病患者120例，其中，男60例，女60例，年龄56.6±7.5岁，记录受试者性别、年龄、血压、身高、体重、病程等资料。排除标准：(1)1型糖尿病、妊娠糖尿病、继发性糖尿病，2型糖尿病并发酮症酸中毒等急性并发症；(2)肝肾功能不全、急性脑出血或脑梗死、肿瘤、外伤等；(3)自身免疫性肝病、慢性病毒性肝炎、药物性肝病和其他遗传性疾病所致的肝病和大量饮酒；(4)近1个月内使用过降糖、降脂、降压等各类药物。依据糖尿病肾病诊断标准[3]，按尿清蛋白/尿肌酐比值(UACR)将研究对象分为3组，即正常清蛋白尿组(NA)40例(UACR<30 mg/g)，微量清蛋白尿组(MA)42例(30 mg/g≤UACR<300 mg/g)和大量清蛋白尿组(LA)38例(UACR≥300 mg/g)。另外选择同期于本院体检中心体检健康者40例作为健康人对照组，其中，男21例，女19例，年龄53.7±6.8岁。本研究经过连云港市第二人民医院伦理学委员会批准，受试者均知情同意。

1.2 仪器和试剂 AU5800全自动生化分析仪(美国贝克曼公司)；AP-960全自动酶免分析仪(日本协和医药公司)；Human Podocalyxin(PCX)ELISA Kit(批号：34256022，美国MyBioSource公司)；尿微量清蛋白检测试剂盒(批号：AUZ7698)、肌酐检测试剂盒(批号：AUZ3109)、葡萄糖检测试剂盒(批号：AUZ3314)均购自美国贝克曼公司；FFA检测试剂盒(批号：160113，北京九强公司)。

1.3 标本采集 嘱各研究对象留取新鲜晨尿10 mL，同时采集空腹静脉血5 mL(无抗凝剂)，常温3 000 r/min离心10 min，将尿上清液和血清分装后，置于-80 ℃保存。

1.4 检测方法 尿微量清蛋白测定采用免疫透射比浊法，肌酐测定采用苦味酸法，葡糖糖测定采用己糖激酶法，FFA测定采用酶法，尿PCX测定采用酶联免疫吸附法，采用AU5800全自动生化分析仪、酶联仪及相应的试剂盒检测及结果判读。

1.5 肾小球滤过率计算方法(eGFR) 根据Cockcroft-Gault方程计算：CG-GFR(mL/min)=[(140-年龄)×体重(kg)×88.41×0.85(女性)]/[血肌酐(μmol/L)×72]。

2 结果

2.1 各组临床常规指标特征 结果显示，DN的发生及进展与年龄、舒张压无关，而与糖尿病病程体质指数、收缩压、Glu、肌酐、尿清蛋白、UACR有关。见表1。

表1 各组临床常规指标特征分析

注：-，表示无数据；*，与健康人对照组比较，P<0.05；Δ，与NA组比较，P<0.05；▲，与MA组比较，P<0.05。

2.2 各组血清FFA及尿PCX检测结果 结果显示，糖尿病患者血清FFA及尿PCX水平明显高于健康人对照组，差异均具有统计学意义(P均<0.05)，并伴随糖尿病肾病的进展而升高。见表2。

表2 各组血清FFA及尿PCX检测结果

注：*，与健康对照组比较，P<0.05；Δ，与NA组比较，P<0.05；▲，与MA组比较，P<0.05。

2.3 Pearson相关性分析 以血清FFA为因变量，尿PCX为自变量，进行Pearson相关性分析，结果血清FFA与尿PCX呈正相关(r=0.73,P<0.05)。

2.4 血清FFA与尿PCX单独以及联合检测对DN诊断价值 以eGFR<90 mL/min为cut-off值，通过ROC曲线分析得出，血清FFA诊断最佳切点为0.61 mmol/L，敏感性为74.1%，曲线下面积(AUCROC)为0.82；尿PCX诊断最佳切点是1.61 ng/mL，敏感性为80.6%，AUCROC为0.88；血清FFA与尿PCX联合检测的最佳切点是85.2%，敏感性为89.5%，AUCROC为0.93，均高于单一指标检测结果。见表3、图1。

表3 血清FFA与尿PCX以及联合检测对DN诊断价值

图1 血清FFA和尿PCX单独及联合诊断DN的ROC曲线

3 讨论

DN是糖尿病常见和严重的慢性并发症，导致的不良后果是肾功能衰竭、心血管疾病和过早死亡。研究显示，约有20%～40%的DN患者最终进展为终末期肾病[4]。因此及时、准确的诊断对于患者的预后至关重要[4-5]。尿微量清蛋白在预示DN发生和进展方面是常用的检测指标，但近来的研究表明，当糖尿病患者肾小球滤过率出现下降时，尿微量清蛋白的排泄并未增加，该指标存在滞后性[6]。因此，对于DN早期诊断标志物的研究显得尤为重要。血清FFA是反映脂类代谢紊乱的一个敏感指标，主要由皮下和内脏脂肪脂解生成，是三酰甘油的水解产物，生理情况下人体血清中含量较低，病理状态下具有细胞毒性和组织毒性，能够及时、准确反映机体脂类代谢水平[7]。正常情况下，胰岛素通过对脂解限速酶的抑制作用而减少FFA的生成，2型糖尿病患者由于胰岛素抵抗导致脂肪细胞对胰岛素的抗脂解作用的敏感性下降，或在脂肪组织体积增多的情况下脂解增加，引起血清FFA显著升高[7]。本研究发现，DN各期的血清FFA水平明显高于健康人对照组，且伴随DN的进展而升高，证实FFA在DN的发生、发展过程中发挥重要作用。Yu等[8]研究结果表明，DN患者血浆FFA明显高于对照组，并随着DN进展而升高，与本研究结论基本一致。另有学者推测，血清FFA影响DN的原因为FFA水平的升高导致肾脏小血管和微血管内皮细胞受损，促进微小血管内膜粗糙、增厚及退行性变，加重肾小球硬化；FFA升高加重了DN的胰岛素抵抗等[7,9]。

足细胞参与构成肾小球滤过屏障，对大分子渗透性起决定性作用，其标志蛋白PCX是带有高负电荷的糖蛋白，主要功能是防止足细胞足突坍塌，当肾小球发生病变时，可伴有足细胞脱落而进入尿液，因此，可对尿液中足细胞或其碎片(以PCX标记)进行测定[10]。Habara等[11]应用PCX单克隆抗体和荧光激活细胞分类器测定尿液中PCX阳性成分，结果发现尿液中PCX表达阳性成分越多，肾小球损害则越为严重。本实验采用ELISA法测定尿足细胞标志蛋白PCX，结果显示DN各期尿PCX水平明显高于健康人对照组，并伴随DN进展而升高。目前，DN诊断标志物研究是个热点，但尚未见血清FFA与PCX是否存在关联性报道。通过本研究发现，血清FFA和尿PCX呈明显正相关(r=0.73,P<0.05)，证实两者之间有着密切的关系。研究表明，足细胞中胆固醇聚集导致的脂毒性是DN的关键致病因素，足细胞的丢失是DN的重要标志，而血清FFA的升高、代谢紊乱可导致脂毒性[12]。另有研究显示，在DN早期，FFA氧化和运输紊乱及其抗氧化反应，可破坏足细胞结构，导致肾小球疾病[13]。本实验也证实了上述结论，表明FFA和足细胞损伤有着密切的关联。

本实验通过进一步的研究还发现，在DN诊断价值方面，尿足细胞标志蛋白PCX敏感性优于血清FFA，联合检测则进一步提高DN诊断敏感性、阳性预测值和准确性，因此，在DN早期诊断方面，该指标具有较高的临床预测价值。Hara等[14]研究结果表明，在正常清蛋白尿的糖尿病患者中，有53.8%的患者尿足细胞(以PCX标记)出现升高，说明其对于DN早期诊断阳性率要高于尿清蛋白。Hara等[14]研究结果与本结论一致，但其对DN诊断敏感性低于本研究结果，其可能的原因为：(1)是研究对象存在一定的个体差异；(2)是方法学之间存在差异。由于本研究选取样本量相对偏少，故今后需扩大样本量进行深入的研究。

综上所述，血清FFA和尿PCX对于DN的发生、发展过程中具有重要的诊断价值，其联合检测在DN的发生、发展过程中具有一定的临床预测价值。血清FFA及尿PCX可作为生物学标志物用以预测2型DN的发生和进展。

[1]Sun YM, Su Y, Li J,etal. Recent advances in understanding the biochemical and molecular mechanism of diabetic nephropathy[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013, 433(4):359-361.

[2]American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes 2016[J]. Diabetes Care, 2016, 39(Suppl 1):S1-S112.

[3]中华医学会糖尿病学分会微血管并发症学组. 糖尿病肾病防治专家共识(2014年版)[J]. 中华糖尿病杂志, 2014, 6(11):792-801.

[4]Lee CH, Lam KS. Biomarkers of progression in diabetic nephropathy: The past, present and future[J]. J Diabetes Investig, 2015, 6(3):247-249.

[5]Fiseha T, Tamir Z. Urinary markers of tubular injury in early diabetic nephropathy[J]. Int J Nephrol, 2016, 2016:4647685.

[6]Currie G, McKay G, Delles C. Biomarkers in diabetic nephropathy: Present and future[J]. World J Diabetes, 2014, 5(6):763-776.

[7]Cree-Green M, Gupta A, Coe GV,etal. Insulin resistance in type 2 diabetes youth relates to serum free fatty acids and muscle mitochondrial dysfunction[J]. J Diabetes Complications, 2017, 31(1):141-148.

[8]Yu Y, Suo L, Yu H,etal. Insulin resistance and endothelial dysfunction in type 2 diabetes patients with or without microalbuminuria[J]. Diabetes Res Clin Pract, 2004, 65(2):95-104.

[9]Csala M. Hyper-free fatty acidemia - insulin resistance and β-cell death[J]. Orv Hetil, 2016，157(19):733-739.

[10]杨伏猛, 刘倩, 王彦, 等. 尿足细胞及其标志蛋白podocalyxin测定对2型糖尿病肾病的诊断价值[J]. 临床检验杂志, 2016, 34(5):378-381.

[11]Habara P, Marecková H, Malícková K,etal. Novel flow cytometric method for the detection of podocalyxin-positive elements in urine of patients with glomerulonephritides-first promising results[J]. Folia Biol(Praha), 2012, 58(2):57-63.

[12]Sieber J, Lindenmeyer MT, Kampe K,etal. Regulation of podocyte survival and endoplasmic reticulum stress by fatty acids[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2010, 299(4):F821-F829.

[13]Nosadini R, Tonolo G. Role of oxidized low density lipoproteins and free fatty acids in the pathogenesis of glomerulopathy and tubulointerstitial lesions in type 2 diabetes[J]. Nutr Metab Cardiovasc Dis, 2011, 21(2):79-85.

[14]Hara M, Yamagata K, Tomino Y,etal. Urinary podocalyxin is an early marker for podocyte injury in patients with diabetes: establishment of a highly sensitive ELISA to detect urinary podocalyxin[J]. Diabetologia, 2012, 55(11):2913-2919.

(本文编辑：许晓蒙)

Diagnostic values of serum free fatty acids and urine podocalyxin in the patients with type 2 diabetic nephropathy

LIUQian1,2,YANGFu-meng2,ZHAOShao-lin3,ZHENGPing3,ZHUWei1

(1.MedicalCollegeofJiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu; 2.DepartmentofMedicalLaboratory,LianyungangSecondPeople′sHospital,Lianyungang222006,Jiangsu; 3.DepartmentofMedicalLaboratory,LianyungangFirstPeople′sHospital,Lianyungang222006,Jiangsu,China)

Objective To investigate the diagnostic values of serum free fatty acids(FFA) and urine podocalyxin(PCX) in the patients with type 2 diabetic nephropathy(DN). Methods A total of 120 patients with type 2 diabetes mellitus(DM) were enrolled, and they were divided into three groups, normal albumin group(NA), microalbuminuria group(MA) and heavy albuminuria group(HA), based on the urinary albumin-creatinine ratio(UACR). In addition, 40 healthy persons participated in medical examination were selected as the control group. Serum FFA levels were detected by a biochemical analyzer and urine PCX levels by ELISA. The correlation between them was analyzed by Pearson correlation, and their diagnostic values in type 2 DN were evaluated by the receiver operating characteristic curve(ROC). Results Serum FFA levels in the NA, MA, HA and control groups were(0.61±0.14),(0.81±0.13),(0.95±0.18) and(0.49±0.11) mmol/L, respectively, and urine PCX levels were(1.86±0.45),(4.47±1.48),(6.72±1.40) and(1.38±0.24) ng/mL, respectively. The levels of serum FFA and urine PCX in type 2 DM patients were significantly higher than those in the control group(P<0.05), and increased with the progression of type 2 DM. Pearson correlation analysis showed that serum FFA levels were positively correlated with urine PCX levels(r=0.73,P<0.05). The sensitivity of serum FFA, urine PCX and combined detection in the diagnosis of type 2 DN were 74.1%, 80.6% and 89.5%, respectively, and the latter significantly higher than the former two(P<0.05). Conclusion Serum FFA and urine PCX levels increase significantly in diabetic patients with renal injury, and both of them have important clinical values in the diagnosis of type 2 DN.

diabetic nephropathy; free fatty acid; podocalyxin

10.13602/j.cnki.jcls.2017.03.09

刘倩，1985年生，女，主管技师，大学本科，主要从事临床血液学研究工作。

朱伟,研究员，博士研究生导师， E-mail: zhuwei@ujs.edu.cn。

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2017-01-20)