一汉族玻璃体淀粉样变性家系的TTR基因突变检测

朱培冉，吴秋月，余毛毛，张明超，倪梦霞，刘帅妹，蒋卫军，张静，李卫巍，曹进，李伊，薛春燕，夏欣一

(南京军区南京总医院a.全军检验医学研究所，b.眼科，南京 210002)

一汉族玻璃体淀粉样变性家系的TTR基因突变检测

朱培冉a，吴秋月a，余毛毛a，张明超a，倪梦霞a，刘帅妹a，蒋卫军a，张静a，李卫巍a，曹进a，李伊a，薛春燕b，夏欣一a

(南京军区南京总医院a.全军检验医学研究所，b.眼科，南京 210002)

目的 对一汉族玻璃体淀粉样变性家系的致病基因Transthyretin(TTR)进行检测，明确该家系玻璃体淀粉样变性的致病基因突变位点。方法 采集该家系9个成员(包括临床确诊患者2例，无症状者7例)外周血，提取其基因组DNA。用PCR技术对TTR基因的4个外显子进行扩增，并对扩增产物进行Sanger测序；同时选取100例无血缘关系的健康人作为对照。结果 该家系8例受检者中有4例受检者检测到TTR第2号外显子中第35位的密码子发生了A>C(Lys35Thr)的杂合突变，而100例健康人对照组中均未发现相同突变。结论TTR基因Lys35Thr杂合突变是导致该家系玻璃体淀粉样变性的致病基因。

玻璃体淀粉样变性；甲状腺激素结合蛋白；基因突变

玻璃体淀粉样变性(OMIM:105210)普遍认为是甲状腺激素结合蛋白(Transthyretin，TTR)基因突变所导致的淀粉样物质在眼部组织中沉积所引起的疾病[1]。其发病存在明显的地域以及时间差异。国外研究显示，在葡萄牙北部以及日本地区发病时间约为30岁，而在瑞典以及其他欧洲国家发病时间较晚，一般约为40岁[2-3]。国内的相关报道较少，左晶等[4]报道一少数民族玻璃体淀粉样变性家系的临床观察及分析。谢兵等[5]对由Gly83Arg引起的一玻璃体淀粉样变性家系进行分析，结果显示发病年龄为40～50岁。本研究对一汉族玻璃体淀粉样变性家系的患者及家庭成员进行了TTR基因的检测与分析，旨在确定引起该家系淀粉样变性的致病突变位点，为患者提供遗传诊断，并为遗传咨询和产前诊断提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 先证者(Ⅲ-2)，男，40岁，因2年前无诱因下出现双眼视力渐进性下降，来我院就诊。患者无头痛、头晕、恶心呕吐，无黑影飘动、视物变形、暗点、视野缺损、无眼前闪光感、眩光、眩晕等现象。左眼视力0.02，双眼结膜无充血，角膜透明，前房深浅正常，房水清，虹膜纹理清，色正常，瞳孔圆，直径3 mm，对光反射灵敏晶体尚透明，玻璃体腔内见大量淀粉样物质散在分布，眼底窥不清。体格检查正常，无其他器官组织异常，被诊断为双眼玻璃体淀粉样变性。主诉无既往史，个人史正常，家族史母亲眼睛视力差，小姨妈眼睛近2年视力差。

在征得患者及其家属知情同意后，我们对该家系9名包括先证者(Ⅲ-2),先证者小姨(Ⅱ-7)以及无症状者7名(Ⅱ-4、Ⅱ-8、Ⅲ-3、Ⅲ-4、Ⅲ-7、Ⅲ-8、Ⅳ-1)于2016年8月在我院检验科进行外周血采集(3 mL)。用EDTA-K2抗凝管采集9名成员血液样本，置-80 ℃保存，同时采集同期无血缘关系的体检健康者100例为健康人对照组。本研究经医院医学伦理学委员会批准。

1.2 主要仪器与试剂 PCR扩增仪(Gray-96G，上海山富公司)；凝胶成像分析系统(GelX1650，上海欧翔公司)；PCR电泳仪(PowerPacTMBasic，Bio-Rad公司)；立式超低温保存箱(DW-86L682，Haire公司)；高速离心机(D2012，Scilogex公司)；血液基因组DNA提取试剂盒(DP318-02，北京天根公司)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 按照DNA提取试剂盒说明书操作提取各样本外周血DNA，稀释样品浓度至5～10 ng/μL，置于-80 ℃保存。

1.3.2 PCR扩增 从美国国立生物技术信息中心官方网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查询并获取TTR全基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计TTR基因4个外显子的引物序列(表1)，由上海华大基因公司合成。PCR总反应体系为25 μL，包括10×PCR缓冲液2.5 μL，2.5 mmol/L MgCL2溶液1.5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 2 μL，700 ng/μL DNA模板2 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，5 U/μL Taq酶0.25 μL，ddH2O 14.75 μL。循环参数：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃10 min，4 ℃保存。PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶凝胶。

表1 TTR基因扩增引物序列

1.3.3 测序及序列比对 取PCR产物送华大基因测序公司进行Sanger测序，将测序结果与GenBank文库中的参考序列进行BLAST比对分析。

2 结果

2.1 先证者家系遗传特征 该家系4代共21例，男10例，女11例，已故5例，Ⅱ3和Ⅲ2为患者(图1)。该家系为独立发病的遗传性玻璃体淀粉样变性，患者均于40岁左右发病，临床表现为进行性的单侧或双侧玻璃体混浊以及视力下降。先证者弟弟及女儿均未出现眼部病变。

注：□，正常男性；○，正常女性；■，男性患者；●，女性患者；↗，先证者；□，去世正常男性；○，去世正常女性；●，去世患病女性；■，去世患病男性。

图1 患者家系图谱

2.2TTR基因PCR扩增及测序结果 受检者(Ⅱ-4、Ⅱ-7、Ⅱ-8、Ⅲ-2、Ⅲ-3、Ⅲ-4、Ⅲ-7、Ⅲ-8、Ⅳ-1)TTR基因的4个外显子均扩增出预期大小的DNA片段，测序后发现家系成员(Ⅱ-7、Ⅲ-2、Ⅲ-3、Ⅳ-1)在TTR基因的第2号外显子中第35位的密码子均发生了A>C的杂合突变(AAG→ACG,图2A)，其在该位点的编码氨基酸由赖氨酸变为了苏氨酸。而在其家系中其余受检者以及100例健康人对照组中均未检测到该突变(图2B)。

3 讨论

TTR是一种可溶性的四聚体蛋白，主要在肝脏中合成，在血液循环中主要转运甲状腺激素和视黄醇结合蛋白。该病的发病机制并不清楚,其可能的机制是由于TTR基因的突变引起了四聚体的解体，解体后的单体由于自我聚集形成淀粉样的物质沉积，从而引起组织功能异常甚至衰竭[6]。Ruzhansky等[7]发现一美国双胞胎姐妹携带TTR基因2号外显子第35位的密码子的杂合突变A>C(Lys35Thr)，从而导致玻璃体淀粉样变性。国内文献对该位点突变引起的玻璃体淀粉样变性的报道较少，王辉林等[8]研究发现，TTR基因Lys35Thr、Leu55Agr、Lys35Asn、Ser100Ser位点突变均可导致玻璃体淀粉样变性，并且Lys35Thr突变引起的玻璃体淀粉样变性家系中存在携带该突变位点的未发病成员。Long等[9]发现一玻璃体淀粉样变性的家系中TTR基因2号外显子第35位的密码子发生了A>C(Lys35Thr)的杂合突变，且在该家系中也发现有携带该突变位点的未发病成员。谢兵等[5]发现TTR基因3号外显子Gly83Arg杂合突变可导致玻璃体淀粉样变性。以上结果均表明，引起的玻璃体淀粉样变性的突变位点众多，给临床诊疗带来了较多困难。

本研究通过对该家系TTR基因进行Sanger测序发现该家系先证者(Ⅲ-2)在2号外显子中第35位的密码子发生了A>C(Lys35Thr)的杂合突变，且先证者女儿(Ⅳ-1)、先证者弟弟(Ⅲ-3)以及小姨(Ⅱ-7)均携带有该突变，但其余携带者均正常。分析原因可能为TTR基因突变的发病的平均年龄为40～50岁[4-5]。结合携带者年龄，可以推测先证者女儿以及弟弟均未到该病的发生年龄。这一延迟性发病的特点提醒我们在携带有Lys35Thr突变的遗传性家系的检查中对表现正常的成员有必要进行基因检测以确定该位点是否发生了突变。从数据库查询以及100例健康人测序结果看，该家系玻璃体淀粉样变性是由TTR基因2号外显子第35位的密码子发生了A>C(Lys35Thr)的杂合突变导致。有力的证明了TTR基因2号外显子Lys35Thr的杂合突变是引起该家系玻璃体淀粉样变性的原因。

注：A，先证者；B,对照组。

图2 遗传性玻璃体淀粉样变性TTR基因第2号外显子部分测序结果

[1]Ueda M, Ando Y. Recent advances in transthyretin amyloidosis therapy[J].Transl Neurodegener,2014,3:19.

[2]Liu T, Zhang B, Jin X,etal.Ophthalmic manifes tations in a Chinese family with familial amyloidpolyneuropathy due to aTTRGly83Arg mutation[J].Eye(Lond), 2014, 28(1): 26-33.

[3]Adams D, Théaudin M, Cauquil C,etal.FAP neuropathy and emerging treatments[J].Curr Neurol Neurosci Rep,2014,14(3):435.

[4]左晶,王育良,黄玲,等.玻璃体淀粉样变性一家系临床观察[J].中国实用眼科杂志,2014,32(8):1019-1021.

[5]谢兵,蔡善君,蒋模,等.家族性玻璃体淀粉样变性甲状腺激素结合蛋白Gly83Arg突变家系[J].中华眼底病杂志,2016,32(3):89-91.

[6]Nagasaka T. Familial Amyloidoticpoly neuropathy and transthyretin[J].Springer Netherlands,2012,65(32):920-922.

[7]Ru zhan sky K,Scoon J,Weimer LH,etal.Discordant phenotypein monozygotic female twins with Lys35ThrTTRfamilial amyloidotic polyneuropathy[J].J Clin Neuromuscul Dis, 2014, 16(1): 1-6.

[8]王辉林,龙达，曾军，等.家族性淀粉样多神经病致病基因突变分析[C].全国医学遗传学学术会议,2009年.

[9]Long D,Zeng J,Wu LQ,etal.Vitreous amyloidosis in two large mainland Chinese kindreds resulting from transthyretin variant Lys35Thr and Leu55Arg[J].Ophthalmic Genet,2012,33(1):28-33.

(本文编辑：许晓蒙)

Pathogenic gene mutation in a Han Chinese family with hereditary vitreous amyloidosis identified by Sanger sequencing

ZHUPei-rana，WUQiu-yuea，YUMao-maoa，ZHANGMing-chaoa，NIMeng-xiaa，LIUShuai-meia，JINGWei-juna，ZHANGJinga，LIWei-weia，CAOJina，LIYia，XUEChun-yanb，XIAXin-yia

(JinlingHospital，NanjingUniversitySchoolofMedicinea．InstituteofClinicalLaboratoryMedicine，PLA，b．OphthalmologyDepartment，Nanjing210002，Jiangsu,China)

Objective Our purpose was to investigate the pathogenic gene mutation of a Han Chinese family with vitreous amyloidosis. Methods The 9 individuals(proband, 1 affected member and 7 unaffected members) of the family were selected and their DNA was extracted from peripheral blood. The 4 exons of transthyretin(TTR) gene were amplified by polymerase chain reaction(PCR) technique. The amplified products ofTTRgene were sequencing by Sanger technique. We also selected 100 unrelated healthy individual as the control group. Results By DNA sequencing, a heterozygous mutation was found in 4 of the 9 subjects from the family. The transition of adenine to cytosine(AAG>ACG) was detectable in exon 2 ofTTR, which changed the amino acid composition at codon 35(Lys35Thr). This mutation did not presented in control group. Conclusion The heterozygosis mutation ofTTRgene Lys35Thr should be a pathogenic mutation for the family with vitreous amyloidosis.

vitreous amyloidosis; transthyretin; gene mutation

10.13602/j.cnki.jcls.2017.03.07

南京军区总医院院管题(2015046)；南京市科技计划项目(201605004)。

朱培冉，1990年生，男，硕士研究生，研究方向为分子遗传学；吴秋月，1989年生，女，技师，硕士，研究方向为分子遗传学。二人对该研究具有同等贡献，同为第一作者。

夏欣一，副主任医师，副教授，E-mail: xxybio@126.com;薛春燕，副主任医师，博士，E-mail：xuechunyancn@163.com。

R776.4

A

2017-01-18)