胃癌患者血清外泌体中DANCR表达及其临床意义*

李阳，潘磊，梁炜，张鹏，钱晖，许文荣，张志坚，蒋鹏程，张徐

(1.江苏大学医学院，江苏省检验医学重点实验室，江苏镇江 212013；2.无锡市中医医院检验科，江苏无锡，214000；3.江苏大学附属人民医院普外科，江苏镇江 212002)

·临床实验研究·

胃癌患者血清外泌体中DANCR表达及其临床意义*

李阳1,2，潘磊1,3，梁炜1，张鹏1，钱晖1，许文荣1，张志坚1，蒋鹏程3，张徐1

(1.江苏大学医学院，江苏省检验医学重点实验室，江苏镇江 212013；2.无锡市中医医院检验科，江苏无锡，214000；3.江苏大学附属人民医院普外科，江苏镇江 212002)

目的 检测胃癌患者血清外泌体(exosome)中抗分化非编码RNA(DANCR)的表达水平并分析其临床应用价值。方法 采用实时荧光定量RT-PCR检测胃癌细胞培养上清和胃癌患者血清exosome中DANCR表达水平，分析其与临床病理资料的相关性，绘制ROC曲线评价其诊断效能。结果DANCR在人胃癌细胞系HGC-27中表达水平(4.43±0.37)明显高于胃黏膜上皮细胞(1.01±0.01)，差异有统计学意义(P<0.05)。HGC-27细胞培养上清exosome中DANCR表达水平(3.06±0.14)明显高于GES-1细胞(1.01±0.20)，差异有统计学意义(P<0.05)。DANCR在胃癌患者血清exosome中的平均含量[5.060(1.380, 22.785)]较胃良性疾病患者[0.535(0.340, 1.380)]和体检健康者[1.200(0.605, 1.655)]明显升高(Z分别为-3.409,-4.229,P均<0.01)，且与肿瘤大小、TNM分期以及淋巴结转移相关。胃良性疾病患者与体检健康者相比，血清exosome中DANCR含量差异无统计学意义(Z=-1.308,P>0.05)。胃癌患者血清exosome中DANCR的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.777，95%可信区间(CI)为0.678～0.876，cut-off值2.50，敏感性为68.6%，特异性为84.4%。结论 胃癌患者血清exosome中DANCR表达水平升高，有望成为胃癌诊断的新指标。

胃癌；外泌体；抗分化非编码RNA；血清

外泌体(exosome)是细胞分泌的一种膜性囊泡，通过携带多种生物活性分子(包括蛋白质和核酸)，介导细胞间信号传递[1]。近期研究发现，exosome在肿瘤患者血清中稳定存在，exosome及其来源分子在肿瘤诊断、疗效监测和预后判断中具有良好应用价值[2-4]。本研究通过检测胃癌细胞培养上清exosome及胃癌患者血清exosome中抗分化非编码RNA(anti-differentiation antagonizing noncoding RNA,DANCR)的表达水平，并分析其临床意义，以评估exosome中DANCR作为胃癌诊断新指标的临床效能。

1 材料和方法

1.1 研究对象 采集2015年7月至2016年7月江苏大学附属人民医院普外科就诊的51例胃癌患者，男42例，女9例，年龄35～88岁，中位年龄61岁。所有纳入的胃癌患者均经病理组织学活检确诊，标本采集前均未行放化疗、手术治疗或全身治疗。排除其他肿瘤病史以及术前行化疗或放疗等辅助治疗的患者。根据TNM分期系统(2010年第7版)进行肿瘤分期。选取同期就诊的经胃镜确诊为胃炎且不同时患有其他消化系统疾病的12例患者作为胃良性疾病组，男7例，女5例，年龄34～78岁，中位年龄56岁。收集同期年龄和性别匹配的体检健康者32例作为对照组，男18例，女14例，年龄32～75岁，中位年龄58岁。标本采集经江苏大学医学伦理学委员会批准，患者及家属知情同意。

1.2 血标本采集及处理 采集各研究对象治疗前(体检健康者体检时)的空腹静脉血，4 ℃、300×g离心10 min分离血清，4 ℃、12 000×g离心10 min以去除细胞碎片，血清分装后置-80 ℃保存。

1.3 细胞系、主要试剂和仪器 人胃黏膜上皮细胞系GES-1、人胃癌细胞系HGC-27购自中科院上海细胞库；胎牛血清、RPMI-1640培养基、胰蛋白酶(Gibco公司)，exosome提取试剂盒(SBI公司)，Trizol提取液(Invitrogen公司)，QIAzol裂解液、RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒(Qiagen公司)，2×SYBR Green PCR Master Mix(康为世纪公司)；cobos e601电化学发光免疫分析仪及配套的CEA 和CA199检测试剂盒(Roche公司),CFX96荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司)，NanoDrop 2000超微量分光光度计(Thermo公司)。

1.4 细胞培养及上清收集 取生长状态良好的GES-1(5×105个)和HGC-27(5×105个)细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。待细胞融合度达50%时，PBS洗涤3次，更换为无血清培养基继续培养，48 h后收集上清，4 ℃、300×g离心10 min去除细胞碎片，0.22 μm滤膜过滤后分装冻存于-80 ℃。

1.5 细胞上清及血清exosome提取 按照血清exosome提取试剂盒说明书操作提取胃癌患者、胃良性疾病患者、体检健康者血清(各250 μL)及胃癌细胞、胃黏膜上皮细胞培养上清(各250 μL)中的exosome，样本置-20 ℃保存。

1.6 RNA提取及逆转录反应 用Trizol试剂提取胃癌细胞系HGC-27(1×106个)和胃黏膜上皮细胞系GES-1(1×106个)总RNA，用QIAzol裂解液提取胃癌细胞培养上清、胃癌患者、胃良性疾病患者及体检健康者血清exosome中总RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度计检测RNA浓度和纯度，取吸光度(A260/280 nm)为1.8～2.0的RNA样本，按逆转录试剂盒说明书操作将RNA逆转录为cDNA，均置-20 ℃保存。

1.7 实时荧光定量PCR 采用Primer Premier 5.0 软件设计DANCR(NR_024031.2)和U6(NG_043158.2)的引物，并由上海英潍捷基公司合成。DANCR上游引物序列(F)：5′-GCGCCACTATGTAGCGGGTT-3′；下游引物序列(R)：5′-TCAATGGCTTGTGCCTGTAGTT-3′，产物片段大小为156 bp。U6上游引物序列(F)： 5′-CTCGCTTTGGCAGCACA-3′； 下游引物序列(R)：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，产物片段大小为94 bp。采用CFX96实时荧光定量PCR仪进行分析。荧光定量PCR反应体系: 2×SYBR Green PCR Master Mix 5 μL、上、下游引物(5 mmol/L)各1 μL、cDNA 样本1 μL、RNase-free ddH2O 12 μL。循环参数：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40个循环。采用CFX96 Manager软件于72 ℃时采集荧光信号及进行熔解曲线分析。DANCR的相对表达水平以2-ΔΔCt法计算，公式：ΔΔCt=[(样本Ct目的基因-样本Ct管家基因)-(对照组Ct目的基因-对照组Ct管家基因)]。

1.8 血清CEA 和CA199检测 按照cobos e601电化学发光免疫分析仪及配套试剂盒说明书操作检测各研究对象血清CEA和CA199的表达水平。CEA参考范围为0～10 ng/mL，CA199参考范围为0～30 U/mL。

2 结果

2.1DANCR在胃癌细胞及其培养上清exosome中的表达 定量RT-PCR检测结果显示，DANCR在HGC-27细胞中含量(4.43±0.37)明显高于GES-1细胞(1.01±0.01)，差异有统计学意义(t=-13.106，P<0.05)；DANCR在HGC-27细胞培养上清exosome中的表达水平(3.06±0.14)亦明显高于GES-1细胞(1.01±0.20)，差异有统计学意义(t=-20.006，P<0.05)。

2.2DANCR在胃癌患者血清exosome中的表达DANCR在胃癌患者血清exosome中的含量[5.060(1.380, 22.785)]较胃良性疾病患者[0.535(0.340, 1.380)]和体检健康者[1.200(0.605, 1.655)]均明显升高(Z分别为-3.409，-4.229,P均<0.01)，而胃良性疾病患者与体检健康者间差异无统计学意义(Z=-1.308,P>0.05)。

2.3DANCR与临床资料相关性分析DANCR的表达水平与胃癌患者肿瘤大小、TNM分期以及淋巴结转移相关，而与性别、年龄、分化程度、浸润深度及血管或神经受累无关。见表1。

表1 胃癌患者血清exosomes内DANCR表达水平与临床病理参数的关系

参数例数DANCR相对表达量ZPr性别 男425.44(2.19,22.86)-1.8780.060-0.266 女91.52(1.00,20.25)年龄(岁) <60149.04(1.36,19.28)-0.0800.937-0.011 ≥60374.69(1.52,24.03)肿瘤大小(cm) <5221.54(0.96,26.13)-3.3970.0000.480 ≥5295.82(3.12,16.35)分化程度* 中分化228.65(1.53,28.20)-0.0770.5390.088 低分化264.01(1.05,15.30)淋巴结转移 有3611.22(3.57,32.41)-3.7320.0000.528 无151.24(0.99,3.32)浸润深度 T1/T246.44(1.21,12.81)-0.9320.3560.132 T3/T4475.06(1.54,25,12)TNM分期 Ⅰ/Ⅱ期151.24(0.99,4,71)-3.7320.0000.524 Ⅲ/Ⅳ期369.22(3.06,31.12)血管或神经受累 有137.31(3.12,20.25)-1.2730.2060.180 无384.48(1.15,22.86)

注：*，3例病例资料缺失。

2.4 胃癌患者血清exosome中DANCR的ROC曲线分析及诊断效能 以胃良性疾病患者和体检健康者作为对照组(44例)，胃癌患者作为疾病组(51例)，绘制ROC曲线分析胃癌患者血清exosome中DANCR的诊断价值。胃癌患者血清exosome中DANCR的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.777，95%可信区间(CI)为(0.678～0.876)，当cut-off 值为2.50时，敏感性为68.6%，特异性为84.4%。血清exosome中DANCR对胃癌的诊断效能高于CEA(AUCROC=0.537) 和CA199(AUCROC= 0.596)。

3 讨论

Exosome的内容物主要包括DNA、mRNA、微小RNA(microRNA, miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)等。LncRNA是一类长度大于200个核苷酸的RNA，无蛋白质编码能力，但可通过多种机制参与调控肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等重要生物学功能[5-7]。最近研究发现，不同的肿瘤细胞exosome中均富含lncRNA[8-9]，但有关肿瘤患者血清exosome中lncRNA表达及其临床应用价值的研究仍较少。Liu等[9]报道CRNDE-h可在结肠癌患者血清exosome中被检测出，其高表达提示患者预后不良；且当cut-off值为0.02时，AUCROC可达0.892，灵敏度70.3%，特异性94.4%，比传统指标CEA的诊断效能更佳，具有成为结肠癌血清诊断和预后标志物的潜在价值。此外，有研究还发现肿瘤细胞可以通过释放exosome的形式在不同细胞间传递lncRNA[10]。Qu等[11]报道舒尼替尼耐药的肾癌细胞可通过exosome传递lncARSR至舒尼替尼敏感的肾癌细胞中，发挥ceRNA作用，还可通过与miR-34和miR-449结合，上调AXL和c-MET表达，诱导耐药性产生，表明肿瘤细胞exosome介导的lncRNA转运是参与肿瘤恶性进展的重要机制。

Yuan等[11]最早通过芯片分析在肝癌中检测出DANCR，发现其高表达于肝癌组织中，且与肝癌患者预后不良相关。随后，Ma等[12]证实DANCR具有促进肝癌生长和转移的作用，可作为肝癌分子诊断的指标。Jia等[13]发现DANCR在前列腺癌中的表达水平升高，具有促进肿瘤转移的作用。Liu等[14]也发现在结肠癌中DANCR表达上调。然而，DANCR在胃癌中的表达情况仍不非常清楚。Karlsson等[15]通过高通量筛选发现人乳汁来源的胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)中存在DANCR，但是到目前为止，国内尚未见DANCR在肿瘤EVs(包括exosome)中的相关报道。本研究发现胃癌细胞exosome及胃癌患者血清exosome中可检测出DANCR，而且胃癌细胞exosome中DANCR表达水平较胃黏膜上皮细胞明显增加，胃癌患者血清exosome中DANCR表达水平较胃良性疾病患者和体检健康者亦明显增加，且胃癌患者血清exosome中DANCR高表达与肿瘤大小、TNM分期和淋巴结转移相关，这与Liu等[14]在结肠癌中的报道相一致。此外，ROC曲线分析结果显示胃癌血清exosome中DANCR的AUCROC达0.777，优于传统血清学指标CEA和CA199，提示DANCR具有成为胃癌诊断新指标的潜能。但DANCR在肿瘤中的作用机制尚不明确，目前仅有少量报道，如Yuan等[11]报道DANCR在肝癌细胞中通过与β-cateninmRNA结合，抑制miR-214/320a/199a降解β-cateninmRNA，从而上调β-catenin蛋白表达，促进肝癌细胞干性维持。Jia等[13]报道在前列腺癌细胞中DANCR通过介导EZH2结合到TIMP-2/3基因启动子区，下调其表达水平，从而促进前列腺癌细胞迁移和侵袭。以上研究提示DANCR可能通过与蛋白质或RNA结合进行基因表达调控，从而在肿瘤发生、发展中发挥重要的促进作用。

本研究不足之处在于样本量相对较少以及未分析DANCR表达水平与胃癌患者的预后关系。后续研究中我们将扩大样本验证DANCR在胃癌患者血清exosome中的表达，比较其在胃癌患者术前/术后血清exosome中表达水平的变化，并分析其与胃癌生存率的相关性。此外，我们还将探讨exosome来源的DANCR在胃癌中的生物学作用及机制，以进一步明确其在胃癌诊断中的应用价值。

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(本文编辑：许晓蒙)

Detection and clinical value of serum exosomalDANCRin gastric cancer patients

LIYang1,2,PANLei1,3,LIANGWei1,ZHANGPeng1,QIANHui1,XUWen-rong1,ZHANGZhi-jian1,JIANGPeng-cheng3,ZHANGXu1

(1.JiangsuKeyLaboratoryofMedicalScienceandLaboratoryMedicine,SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,WuxiTraditionalChineseMedicineHospital,Wuxi214000,Jiangsu; 3.DepartmentofGeneralSurgery,theAffiliatedPeople′sHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212002,Jiangsu,China)

Objective To detect the expression levels of anti-differentiation antagonizing noncoding RNA(DANCR) in exosomes from serum of gastric cancer patients and evaluate its clinical application. Methods The expression levels ofDANCRin exosomes derived from the culture supernatants of gastric cancer cell lines and the serum samples of gastric cancer patients were detected by using real-time qRT-PCR. The correlations betweenDANCRlevels and the clinicopathological parameters were analyzed. A receiver operating characteristic(ROC) curve was drawn to evaluate the diagnostic efficiency ofDANCR. Results The expression level ofDANCRin HGC-27 cell(4.43±0.37) was significantly higher than that in GES-1 cells(1.01±0.01)(P<0.05). The expression levels ofDANCRin exosomes from the supernatants of HGC-27 cells(3.06±0.14) were significantly higher than that from GES-1 cells(1.01±0.20)(P<0.05). The expression levels ofDANCRin exosomes from the serum samples of gastric cancer patients [5.060(1.380, 22.785)] were significantly higher than that in gastric benign disease [0.535(0.340, 1.380)](Z=-3.409,P<0.01) and healthy controls [1.200(0.605, 1.655)](Z=-4.229,P<0.01). There was no significant difference in the expression levels of serum exosomalDANCRbetween gastric benign disease group and healthy control group(Z=-1.308,P>0.05). In addition, the expression levels ofDANCRin gastric cancer patients were related to tumor size, TNA stage and lymph node metastasis. The area under the ROC curve of serum exosomalDANCRexpression levels was 0.777 in the diagnosis of gastric cancer, the 95% confidence interval was 0.678 to 0.876 and the cutoff value was 2.50. The sensitivity was 68.6% and the specificity was 84.4%. Conclusion The expression level of serum exosomalDANCRmay increase in gastric cancer patients and could be served as a novel marker for the diagnosis of gastric cancer．

gastric cancer; exosome; anti-differentiation antagonizing noncoding RNA; serum

10.13602/j.cnki.jcls.2017.03.04

国家自然科学基金面上项目(81572075, 81672416)；江苏省自然科学基金面上项目(BK20141303)；江苏省重点研发计划(社会发展)项目(BE2015667)；镇江市重点研发计划(社会发展)项目(SH2015034)；江苏省“青蓝工程”。

李阳，1983年生，男，主管技师，硕士研究生，从事临床分子生物学检验研究。

张徐，副教授，博士研究生导师，E-mail：xuzhang@ujs.edu.cn。

R375.2

A

2016-12-20)