液相色谱串联质谱法和循环酶法测定血清中同型半胱氨酸的相关性

赵瑞，李鹏飞，于伟越，杜萍，赵志霞，刘洪川，刘丽宏

(首都医科大学附属北京朝阳医院药事部，北京 100020)

液相色谱串联质谱法和循环酶法测定血清中同型半胱氨酸的相关性

赵瑞，李鹏飞，于伟越，杜萍，赵志霞，刘洪川，刘丽宏

(首都医科大学附属北京朝阳医院药事部，北京 100020)

目的 分析液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法与循环酶法测定人血清中同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)浓度的相关性。方法 收集63例患者的血清样本，用LC-MS/MS法和循环酶法分别测定相同样本的HCY浓度，并评价2种方法的相关性。结果 LC-MS/MS法与循环酶法对HCY浓度测定的结果分别为(19.11±15.69)μmol/L和(16.95±14.41)μmol/L，差异有统计学意义(t=6.25，P<0.05)。2种方法的线性回归方程为YLC-MS/MS法=1.074X循环酶法+0.892，相关系数(R)=0.987，相关性较好。结论 LC-MS/MS法与循环酶法测定血清中HCY浓度的相关性较好，LC-MS/MS法适用于临床对HCY的检测。

同型半胱氨酸；液相色谱串联质谱法；循环酶法；相关性

同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)是心脑血管疾病的独立危险因素[1-3]。因此，HCY测定对于心脑血管疾病的预防和早期诊断具有重要意义。近年来临床常用的HCY检测方法有生化法[4]、免疫法[5]、循环酶测定法[6]和液相色谱串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)法[7]等，LC-MS/MS法测定血清HCY浓度具有分析时间短、样品处理快速简便、专属性强、准确性和灵敏度高以及成本低等优点。本研究通过比较分析2种方法对同一HCY血清样本的检测结果，评价2种方法的相关性，为临床采用LC-MS/MS法测定HCY提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 仪器及试剂 3200MD型质谱仪及Analyst 1.6.1工作站(美国AB SCIEX公司)，LC-20ADXR液相分析仪(日本岛津公司)；同型半胱氨酸检测试剂盒(液相色谱-串联质谱法，上海复星长征公司)。ADVIA®2400全自动生化分析仪(德国西门子公司)，同型半胱氨酸测定试剂盒(循环酶法，中生北控公司)。

1.2 LC-MS/MS法

1.2.1 色谱条件和质谱条件 色谱条件：色谱柱为KinetexTM2.6 μm C18色谱柱，100 mm×3 mm；流动相：含0.02 %甲酸的水溶液和含0.02 %甲酸的甲醇溶液梯度洗脱，洗脱程序见表1；流速为0.2 mL/min，进样量为20 μL。质谱条件：离子源：电喷雾离子源(ESI)，正离子方式扫描；离子喷射电压：5 500 V；雾化温度：400 ℃；雾化气/辅助气(GS1/GS2)：50 psi；气帘气(Curtain Gas)：20 psi；碰撞气(Collision CAD)：5 psi；去簇电压：25 V；碰撞电压：15 V；扫描模式为多重反应监测(MRM)；Q1/Q3离子通道分别选择为m/z：136.1→90.1(同型半胱氨酸)和140.1→94.1(内标)。

1.2.2 样品处理 准确吸取50 μL待测样本于1.5 mL离心管中，分别加入50 μL内标液(DL-高胱氨酸-D8溶液)和50 μL还原剂(1,4-二硫苏糖醇溶液)，混匀；室温放置30 min后，再加入50 μL蛋白质沉淀剂(三氯醋酸溶液)，涡旋混合30 s，15 000 r/min离心3 min，吸取上清，按照同型半胱氨酸检测试剂盒进行检测。试剂盒检测线性范围为5～45 μmol/L,超出范围样品稀释后复测。

表1 液相梯度洗脱程序

1.3 循环酶法 采用ADVIA®2400全自动生化分析仪和同型半胱氨酸测定试剂盒(循环酶法)进行样品处理(同1.2.2所示)和检测，每个样本的处理和测定1次。试剂盒检测线性范围为3～50 μmol/L,超出范围样品稀释后复测。

1.4 研究对象 收集2016年6月21-22日在我院进行HCY检测的血清样本63例，男25例，年龄26～82岁，中位年龄56岁；女性39例，年龄26～81岁，中位年龄57岁。本研究获得医院医学伦理学委员会批准。采集各研究对象清晨空腹静脉血3～4 mL，置于2～8 ℃保存，2 h内分离血清并进行检测。排除严重溶血、污染的样本。

2 结果

2.1 HCY浓度检测结果 结果显示， LC-MS/MS法与循环酶法检测HCY浓度的结果分别为(19.11±15.69)μmol/L和(16.95±14.41)μmol/L，差异有统计学意义(t= 6.25，P<0.05)。

2.2 相关性检验结果 LC-MS/MS法与循环酶法测定结果具有明显的线性关系，线性回归方程式为：YLC-MS/MS法=1.074X循环酶法+0.892，相关系数(R)=0.987，P<0.05，两法的相关性良好。

3 讨论

血清HCY水平是临床上早期诊断心脑血管疾病的重要指标[8-9]，对心血管疾病和许多其它疾病的预防、诊断、治疗都有重要的临床意义。目前，测定HCY的方法有很多种，例如生化法、免疫法和高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法等，每种方法都有其优缺点。据统计，循环酶法是参加室间质评实验室中选用数量最多的方法[10]。但循环酶法存在反应过程复杂、特异性不强，并且所需试剂昂贵等缺点，而LC-MS/MS法具有特异性好、灵敏度高、检测速度快等优点，并且可以批量处理标本，进行高通量检测，近年来其在临床检测中的应用越来越广泛，尤其适合开展大规模临床HCY研究。

为了保证临床用2种检测方法得到的结果一致性好、可参考价值高，本实验对2种检测结果的相关性进行研究以及结果分析。在样本的采集过程中，由于全血样本采集离体后仍然能持续合成HCY，因此，为了保证2种方法评价结果客观、准确，本研究严格要求采集过程，采血后立即置于2～8 ℃保存，并在2 h内离心分离血清。循环酶法测定血清HCY的主要干扰因素为血氨，而有学者发现，血氨浓度<70 μmol/L时，HCY浓度测定值与原始值的偏差均<5%[10]。另外，当血红蛋白≤3.75 g/dL、胆红素≤20 mg/dL、乳糜≤1 000 mg/dL、维生素C≤10 mg/dL时对循环酶法测定血清HCY无明显干扰[11]。本实验为了排除以上干扰，要求血清新鲜，无黄疸，排除严重溶血、污染的样本，否则测定结果会高于实际浓度。在样本存放及预处理的步骤保持一致，避免了该过程人为造成的误差。

本实验对2种方法测定结果统计分析显示，2组数据结果存在统计学差异(P<0.05)，因此，建议在临床上提供HCY检验报告时，同时提供方法学的信息，以便医生对不同医院采用不同方法的测定结果进行更准确地比对，为患者提供更精准的治疗。此外，对2组结果进行相关性分析，其线性回归方程式YLC-MS/MS法=1.074X循环酶法+0.892，R=0.987，表明2种检测方法在测定浓度范围内相关性良好。然而本研究由于样本量有限，并且每种检测方法只使用了一种试剂盒，更精确的结果间互相推算还需要进一步的研究。

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(本文编辑：许晓蒙)

A correlational study of two methods of concentration determination for serum homocysteine: liquid chromatography-tandem mass spectrometry method and enzymatic cycling assay

ZHAORui,LIPeng-fei,YUWei-yue,DUPing,ZHAOZhi-xia,LIUHong-chuan,LIULi-hong

(DepartmentofPharmacy,BeijingChao-yangHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100020,China)

Objective To analyze the correlation between LC-MS/MS method and enzymatic cycling assay for determination of homocysteine concentration in human serum, and the application of two methods in the determination of homocysteine concentration. Methods Homocysteine concentrations of 63 serum samples were collected and determined by LC-MS/MS method and enzymatic cycling assay, respectively. The correlation between the concentrations by different methods was analyzed and evaluated. Results The concentrations were(19.11±15.69) μmol/L by LC-MS/MS method and(16.95±14.41) μmol/L by enzymatic cycling assay, the P value evaluated by paired-samples T test showed that there was statistical difference among the concentrations determined by two different methods(t=6.25,P<0.05). The conversion formula wasYLC-MS/MS method=1.074Xenzymatic cycling assay+0.892，R=0.987. Conclusion There is good correlation between LC-MS/MS method and enzymatic cycling assay for the determination of homocysteine concentration in serum, providing a theoretical basis for estimating the concentrations in the same serum sample by the two methods.

homocysteine; LC-MS/MS method; enzymatic cycling assay; correlation

10.13602/j.cnki.jcls.2017.03.03

北京市金桥工程种子资金(2014-46-C)。

赵瑞，1986年生，女，博士，研究实习员，主要从事药物分析和临床检验的研究。

刘丽宏，主任药师，博士，E-mail：hongllh@126.com。

R446.11

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2016-10-02)