基于液质联用技术对急性血瘀证大鼠动物模型的代谢研究*

黄 烁，孙明谦，孙 蕾，刘建勋

(中国中医科学院西苑医院基础医学研究所， 北京市中药药理重点实验室,北京 100091)

基于液质联用技术对急性血瘀证大鼠动物模型的代谢研究*

黄 烁，孙明谦，孙 蕾，刘建勋△

(中国中医科学院西苑医院基础医学研究所， 北京市中药药理重点实验室,北京 100091)

目的：通过基于液质联用技术的代谢组学方法发掘急性血瘀证大鼠动物模型的潜在生物标志物，探索该中医证候模型的发病机制。方法：SD大鼠分为正常组和模型组，应用液相色谱和质谱联用仪的代谢组学方法检测急性血瘀证大鼠血清中代谢物的变化，通过PLS-DA等模式识别方法进行数据处理。结果：与正常组比较，模型组的脂肪酸代谢、磷脂酰胆碱代谢、神经鞘磷脂代谢出现异常。结论：急性血瘀证模型中磷脂酰胆碱、脂肪酸、神经鞘磷脂等成分的代谢都受到了干扰，这些代谢途径的变化可能导致能量代谢的异常，影响血小板功能，进而导致血瘀证的发生。

血瘀；代谢组学；生物标记物； 液质联用

血瘀证是指人体内血行不畅、壅阻血脉或血溢脉外、停积为瘀的证候。如何应用现代科学技术手段对血瘀证的科学内涵进行阐释，也是中医药现代化研究的重要课题。代谢组学反映了多种因素作用下的终点效应,已经在实验动物模型评价中展现出其特色和优势[2-3]。其基于整体性研究和系统性的理念比较适合中医药作用的特点，将二者有机结合是非常有意义的工作[1]。本文拟采用高效液相串联飞行时间质谱(LC-TOF-MS)结合多元统计分析方法，对急性血瘀证大鼠模型进行代谢组学研究，发掘与血瘀证模型相关生物标志物与相关代谢途径，从而深入探索其发病机制。

1 材料

1.1 动物

SPF级健康雄性SD大鼠22只，体质量(240±10)g，购于北京斯贝福实验动物科技有限公司(许可证号SCXK(京)2011-0004)。

1.2 药物及试剂

色谱纯乙腈(美国Fisher 公司)、色谱纯甲酸(美国J.T.BAKER公司)、纯净水(中国娃哈哈有限公司)、肾上腺素注射液(杭州和丰制药有限公司)。

1.3 仪器

1200 HPLC 系统(美国Agilent公司)，LC-QTOF-MS 6520液相色谱-质谱联用分析仪(美国Agilent公司)，LBY-F/S5 体外血栓形成仪(北京普利生仪器有限公司)。

2 方法

2.1 分组方法

实验大鼠饲养于中国中医科学院西苑医院SPF级动物房，温度(25±2)℃，湿度(40±5)%，大鼠随意饮食饮水。大鼠适应性喂养3 d后，按体质量随机分为正常对照组和急性血瘀证模型组，正常组10只，模型组12只。

2.2 急性血瘀证大鼠模型的建立

参照文献方法[4-5]模型组按0.8 ml/kg体质量皮下注射盐酸异丙肾上腺素，对照组注射等容量的生理盐水共2次，间隔4 h，于第1次注射后2 h，将大鼠放入0 ℃冰水中游泳5 min，然后取出擦干动物毛发水，禁食不禁水24 h。

2.3 大鼠体外血栓形成实验方法

参照文献[6-7]用硅化注射器穿刺腹主动脉取血2 ml，按照Chandler体外法立刻将血注入旋转环内，注入的血量充满旋转环1/2以下(1.8 ml)，迅速密封并置于血栓形成仪上， 旋转10 min(37 ℃)倾出血栓，生理盐水洗涤测量长度，再将血栓条置80 ℃烘箱恒温烘烤3 h,恒重后称其干重。

2.4 血液标本的收集

于造模次日腹主动脉取血5 ml, 样品经3000 rpm， 室温离心 10 min，取上清于-80 ℃冰箱保存。

2.5 液相色谱和质谱联用分析

2.5.1 代谢物萃取 血浆样品在室温下溶化后，取50 μl加入200 μl乙腈溶剂中振荡混合均匀，室温下静止10 min，经12000 rpm、 4 ℃离心 10 min，取上清液进入LC-MS 分析，进样5 μl。

2.5.2 液相色谱条件 液相色谱为美国Agilent 1200 HPLC 系统，包括恒压二元泵、脱气机、自动进样器和柱温箱。RPLC色谱柱 (X-bridge, C18, 3 μm, 2.1×100 mm, Waters, Ireland) 用于常规分离。流动相：A相：0.1% 甲酸溶液；B相：0.1% 甲酸乙腈，梯度为 35% B; 3 min, 60% B; 15 min, 75% B;20 min, 95% B; 22 min, 35% B; 25 min stop,平衡时间3 min。 流速为0.25 ml/min，柱温为35 ℃。

2.5.3 质谱条件 质谱分析采用美国Agilent 6520 series Time of Flight mass spectrometer equipped with an electro-spray ionization (ESI) Interface(LC-QTOF-MS)。采集模式为正离子，扫描范围从80 到1000 m/z，质谱数据储存模式为centroid。雾化气和干燥气均为氮气，碰撞气为氦气。雾化温度350℃，干燥气10.0 L/min，雾化气30 psi，毛细管电压3500 eV。

2.6 统计学方法

通过Mass Hunter 软件产生的数据，进一步输入到Mass profiler professor(MPP)软件中进行分析。MPP分别采用排列、归一化、修正80%规则、数据集分割和数据缩放等方法对数据集进行预处理，所得数据最后应用SIMICAP+统计软件作进一步的 PLS-DA分析。

3 结果

3.1 大鼠体外血栓形成实验结果

表1显示，血瘀模型组与空白组比较，血栓的长度、干重都出现明显的差异(P<0.05,P<0.05)，说明造模成功。

表1 大鼠体外血栓形成实验结果

注： 与正常组比较：*P<0.05，**P<0.01

3.2 LC-MS的代谢轮廓图

图1显示，本实验采用HPLC-TOF-MS 对急性血瘀证大鼠模型血清中的成分进行代谢组学分析。

图1 LC-MS检测样品的总离子流图 图2 血清样本PLS-DAscoreplots平面图

3.3 多元数据分析

本实验利用PLS-DA对急性血瘀证模型与正常组血清样本进行模式识别与区分。图2为2组血清样本的PLS-DA score plots 平面图，结果显示正常组和模型组呈现出明显的区别，说明急性血瘀证大鼠动物模型的体内代谢成分已经受到干扰。PLS-DA数据模型参数: R2=0.994，Q2=0.87。

3.4 潜在生物标志物的筛选

表2显示，在 PLS-DA 分析中以 VIP>1作为标准筛选模型上2组间分离有贡献的变量，它们在模式识别中发挥重要作用，配合以 student’s t test (P<0.05) 作进一步的筛选以获得潜在的生物标志物。通过METLIN、HMDB等数据库对精确分子量、同位素比等数据进行比对，共筛选出13个生物标志成分、大鼠急性血瘀证模型的潜在生物标志成分及相关代谢途径。

表2 大鼠急性血瘀证模型的潜在生物标志成分及相关代谢途径

4 讨论

实验结果显示，模型组中 Arachidonyl lysolecithin，Linolenoyl lysolecithin 等磷脂酰胆碱类成分的含量大幅下降，提示在血瘀证大鼠动物模型中磷脂酰胆碱的代谢出现异常。在模型组中，磷脂酰胆碱的代谢速度加快，提示磷脂酶A2的活性可能上调，导致花生四烯酸、前列腺素、血小板活化因子等成分上调，进而造成心血管疾病和血瘀的发生[8-9]。本实验结果显示，模型组中 7-palmitoleic acid、Linolenic acid 等脂肪酸含量明显下降，而脂肪酸和磷脂的代谢与能量的代谢密切相关，这两类成分在模型组大鼠体内都出现明显下降，提示其能量代谢出现变化。造模过程中，肾上腺素会加强能量的利用和产热作用，冰水刺激也会使产能增加，造成脂肪酸等代谢加强及大量消耗。最终导致大鼠能量物质减少，出现代谢障碍，能量代谢的异常也能导致该模型气血运行不畅，出现精神不振、活动减少等血瘀症状。脂质代谢的紊乱可能是导致血瘀证侯的重要因素[2]。

本实验结果显示，在模型组中3-Dehydrosphinganine和 Dihydrosphingosine 2个神经鞘磷脂类成分出现上调。神经鞘磷脂是形成生物膜的重要脂类成分，也是细胞增殖、分化和凋亡的重要调节因子。最近研究表明，神经鞘脂类成分可以调节脂质的合成，脂蛋白的代谢与心血管疾病密切相关[10]。神经鞘磷脂参与动脉粥样硬化的病理发展，在人类和动物模型中鞘磷脂积聚并形成斑块。神经鞘磷脂的代谢产物促进血管内皮损伤，在维持动脉粥样硬化斑块中炎症细胞的浸润等促进粥样硬化斑块进展方面起作用[11-12]。鞘磷脂成分可以影响血小板的功能，可能改变血小板的能量代谢和信号传导，激活血小板，这也可能是导致大鼠血瘀证的一个重要原因。总之，神经鞘磷脂含量的增高可能导致罹患动脉粥样硬化的风险增大，这类成分可能是急性血瘀动物模型的重要生物标志物。

本文采用代谢组学技术对急性血瘀证大鼠模型的血清样本进行分析，结果显示该模型中磷脂酰胆碱、脂肪酸、神经鞘磷脂等成分的代谢都受到干扰，这些代谢途径的变化可能导致能量代谢的异常，影响血小板功能进而导致血瘀证发生。

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Study on Metabolism of Acute Blood Stasis Rat Model Based on the Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

HUANG Shuo, SUN Ming-qian, SUN Lei, LIU Jian-xun△

(InstituteofBasicMedicalSciencesofXiyuanHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,BeijingKeyLaboratoryofPharmacologyofChineseMateriaMedica,Beijing100091，China) Abstract: Objective:A metabonomics approach based on liquid chromatography coupled time-of-flight mass spectrometry (LC-TOF-MS) was utilized to obtain potential biomarkers of acute blood stasis rat and investigate metabolic mechanism of this TCM syndrome animal model.Method: SD rats were divided into normal group, blood stasis model group.Reversed-phase chromatography was used to separate the endogenous metabolites in serum. Partial least-squares to latent structure-discriminat analysis (PLS-DA) were used for data analysis.Result: Good separations were observed between the normal and model group. The major disturbed metabolic pathways were fatty acids, phosphatidylcholines and sphingolipids metabolism. Conclusion:The study provided further understanding of pathologic mechanism of the TCM syndrome animal model.

Blood stasis; Metabonomics; Biomarkers; LC-MS

国家重点基础研究发展计划(973计划)(2015CB554405)-基于病证结合的气血理论研究；国家自然科学基金资助项目(81202950)-基于代谢组学技术研究中药复方双参通冠方的配伍与作用机制

黄 烁，医学硕士，从事心血管药理学的研究。

△通讯作者：刘建勋，研究员，医学博士，从事心脑血管药理学与新药发现研究，Tel:010-62835601,E-mail:liujx0324@sina.com。

R33

B

1006-3250(2017)03-0332-03

2016-08-13