基于UPLC/Q-TOF-MS研究代谢综合征痰瘀互结证的物质基础*

杨宇峰，徐 娜，滕 飞

(辽宁中医药大学，沈阳 110847)

基于UPLC/Q-TOF-MS研究代谢综合征痰瘀互结证的物质基础*

杨宇峰，徐 娜，滕 飞

(辽宁中医药大学，沈阳 110847)

目的:采用基于超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪(UPLC/Q-TOF-MS)联用的代谢组学技术，研究代谢综合征痰瘀互结证动物模型血清中小分子代谢物的变化。方法：模型组大鼠复制成痰瘀互结证代谢综合征，运用UPLC/Q-TOF-MS技术检测空白对照组和模型组血清样本中的小分子代谢产物，对所得到的代谢指纹图谱进行判别分析，找出具有差异的特征代谢物并追溯其来源。结果：鉴定出的潜在生物标志物主要有溶血磷脂酰胆碱、苯丙氨酸、酪氨酸、十四烷酸、硬脂酸、D-葡糖酸、前列腺素B1等内源性代谢物。结论：痰瘀互结证代谢综合征的发生与糖类、脂类、氨基酸代谢紊乱有关，这些体内的小分子化合物可能是痰瘀互结证代谢综合征中医证候的物质基础。

痰瘀互结证；代谢综合征；代谢组学

代谢组学(metabolic syndrome，MS)通过对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分[1-2]。它以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，再结合模式识别方法，可以判断出生物体的病理生理状态，并有可能找出与之相关的生物标志物[3]。代谢组学所具有的组、群、谱集成分析功能的特点，对于阐明中医证候的本质规律有明显优势。

基于代谢组学在阐明中医证本质方面蕴涵着巨大潜力，本研究采用基于超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪(Ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC/Q-TOF-MS)技术的代谢组学方法，对痰瘀互结证代谢综合征大鼠血清中内源性代谢物进行了分析鉴定，寻找痰瘀互结证代谢综合征病变的特征性代谢产物，确定相关代谢谱，以期阐明痰瘀互结证代谢综合征中医证候生物学的物质基础。

1 材料

1.1 动物

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，体质量(180±20)g，由辽宁中医药大学教学实验中心提供(动物合格证号SCXK(辽)2004-0018)。大鼠按随机数字表法分为空白组和模型组各20只。

1.2 材料与试剂

乙腈(HPLC)、甲醇(HPLC)购自MERK 公司(USA)，甲酸购自TEDIA 公司(USA)，胆固醇购自国药集团化学试剂有限公司(批号F20061011)，链脲佐菌素购自北京邦定泰克生物技术公司(批号STZ-S0130)，其他试剂均为市售分析纯。

1.3 主要仪器设备

超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪(美国Waters 公司)、超低温冰箱(MDF-U53V，三洋)、TG16-WS 台式高速离心机(湘仪离心机仪器有限公司)。

2 方法

2.1 造模方法

模型组给予链脲佐菌素(30 mg/kg)腹腔注射，高脂高糖饲料持续喂养直至12周，复制成痰瘀互结证代谢综合征模型。空白对照组以等量柠檬酸钠缓冲液腹腔注射后普通饲料喂养直至12周。

2.2 样本采集

各组大鼠用异戊巴比妥钠(异戊巴比妥钠麻醉)麻醉，于腹主动脉取血，使用肝素钠抗凝分离血清。

2.3 样本制备

吸取100 μL样本置于离心管中，按1∶1比例加入400 μL色谱级甲醇和乙腈剧烈震荡混合均匀，4℃静置10 min，然后以15000 rpm离心15 min，吸取上层清液并经0.2 μm滤膜过滤，作为待测样品。

2.4 UPLC/Q-TOF-MS 分析

利用MarkerLynx 软件对采集的原始质谱数据进行离子对的提取、峰对齐、峰匹配和基线矫正等操作，并导入到Simca-P11.5软件中分别进行主成分分析和偏最小二乘方判别分析。

3 结果

3.1 原始色谱图检测

图1显示，对所有质控样本(quality control，QC)进行LC-MS分析，得到QC总离子流色谱图。

3.2 主成分分析(PCA)

图2显示，统计分析发现2组样本在PCA上不能分离。

图1 正离子模式下QC的UPLC/Q-TOF-MS总离子流

图2 ESI+模式下痰瘀互结证代谢综合征大鼠血样代谢PCA分析Scores图注：PC=2，R2X=0.227，R 2Y=0.134，Q2=-0.144 Group C=空白组， Group D=模型组

3.3 偏最小二乘方-判别分析(PLS-DA)

图3、4显示，在PLS-DA处理下，模型组与空白组得到很好的分离。结果显示，模型在ESI+模式下(R2X=0.578，R2Y=0.986，Q2=0.892)，即其中57.8%的变量被作为塑造模型的主要成分，98.6%的样本符合模型判别，模型预测能力为89.2%。

图3 ESI+模式下痰瘀互结证代谢综合征大鼠血样代谢PLS-DA分析Scores二维图注：PC=2，R 2X=0.578，R 2Y=0.986，Q2=0.892 Group C=空白组， Group D=模型组

图4 ESI+模式下痰瘀互结证代谢综合征大鼠血样代谢PLS-DA分析loading图

3.4 寻找差异性代谢物

表1显示，本实验将第一主成分的VIP>1且有统计学意义的变量(P<0.05) 作为标记物的判断标准，根据它们精确分子量与Human Metabolome Database(HMDB) 和Metlin等质谱数据库进行信息匹配,鉴定出7种生物标志物，与对照组比较差异显著。

表1 潜在生物标志物鉴定结果

4 讨论

通过实验研究，分析鉴定出了7种与痰瘀互结证代谢综合征大鼠模型相关的潜在生物标记物，将这些潜在生物标志物通过生物化学和生物信息学等数据库检索相关代谢途径，发现痰瘀互结证代谢综合征大鼠模型体内存在葡萄糖代谢、脂肪酸代谢、氧化应激、三羧酸循环、肝糖异生、脂肪酸氧化等代谢途径的异常，而这些潜在的生物标志物正是体内糖类、脂类、氨基酸等代谢紊乱的结果。

溶血磷脂酰胆碱(LPE)是氧化低密度脂蛋白中的主要磷脂。越来越多的证据表明，由LPE介导的信号传导是动脉粥样硬化的重要因素，LPE是动脉粥样硬化发展风险的潜在生物标志物[4]。国外临床研究也揭示了LPE是特异性中风和大动脉动脉粥样硬化新的候选生物标志物，有较高的预测能力[5]。异亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸与空腹血糖水平和胰岛素抵抗密切相关[6]。最新研究表明，芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)与中国人群胰岛素抵抗和糖尿病发生显著相关，这些标志物对未来糖尿病发展具有较高的预测价值[7]。酪氨酸水平还与不良心血管事件有关，研究表明酪氨酸可作为心血管风险的生物标志物[8]。十四烷酸又称为肉豆蔻酸，是一种饱和脂肪酸，与肥胖患者血清葡萄糖和胰岛素敏感性相关[9]，是心血管事件的风险因素[10]。大型前瞻性队列研究发现，十四烷酸与糖尿病风险相关，肝脏新生脂肪通过饱和脂肪酸(肉豆蔻酸)的合成影响胰岛素体内平衡[11]。棕榈油酸是有益的脂肪酸，其脂肪组织分泌的n-7单不饱和脂肪酸与外周组织中降低的胰岛素抵抗相关[12]，它不仅可通过抑制炎症增加胰岛素敏感性，而且通过抑制胰岛素分泌性胰腺β细胞的破坏[13]，改善胰岛素抵抗和糖尿病。前列腺素E2(PGE2)是来源于花生四烯酸的脂质信号，是机体内一系列生理功能的重要调节剂，包括全身性炎症和胰岛素的胰岛素分泌，可抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌[14]。

[1] BAIN JR，STEVENS RD，et al．Metabolomics applied to diabetes research: moving from information to knowledge[J]．Diabetes，2009，58(11):2429-443．

[2] SALEK RM，MAGUIRE ML，et al．A metabolomic comparison of urinary changes in type 2 diabetes in mouse，rat，and human[J]．Physiol Genomics，2007，29(2):99-108．

[3] 刘双梅，李桂林，汤晓丽，等.甲基莲心碱对2型糖尿病模型大鼠作用的代谢组学研究[J]. 中国药理学通报，2012，28(4):490．

[4] AKERELE OA, CHEEMA SK. Fatty acyl composition of lysophosphatidylcholine is important in atherosclerosis[J]．Medical Hypotheses，2015，85(6):754-60.

[5] JOVÉ M, MAURI-CAPDEVILA G, et al．Metabolomics predicts stroke recurrence after transient ischemic attack[J]．Neurology，2015，84(1):36-45.

[6] OTTOSSON F, ERICSON U, et al．Postprandial Levels of Branch Chained and Aromatic Amino Acids Associate with Fasting Glycaemia[J]．Journal of Amino Acids，2016(4):1-9.

[7] CHEN T, NI Y, et al．Branched-chain and aromatic amino acid profiles and diabetes risk in Chinese populations[J]．Scientific Reports，2016, 6:20594.

[8] GRUSON D, HERMANS MP，et al．Sflt-1 in heart failure: relation with disease severity and biomarkers[J]．Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation，2016，76(5):411-416.

[9] BADOUD F, LAM KP, et al．Metabolomics Reveals Metabolically Healthy and Unhealthy Obese Individuals Differ in their Response to a Caloric Challenge[J]．Plos One，2015，10(8):e0134613.

[10] EBBESSON SO, VORUGANTI VS, et al．Fatty acids linked to cardiovascular mortality are associated with risk factors[J]．International Journal of Circumpolar Health，2015，74:28055.

[11] MA W, WU JH, et al．Prospective association of fatty acids in the de novo lipogenesis pathway with risk of type 2 diabetes: the Cardiovascular Health Study[J]．American Journal of Clinical Nutrition，2015，101(1):153-163.

[12] PASSOS ME, ALVES HH, et al．Differential effects of palmitoleic acid on human lymphocyte proliferation and function[J]．Lipids in Health & Disease，2016, 15(1):217.

[13] FEYZABADI Z, PASALAR M. Analysis of Almond-Violet Oil by Gas Chromatography (A Traditional Formula)[J]．Iranian Journal of Medical Sciences，2016，41(3 Suppl):S2.

[14] CARBONEAU BA, BREYER RM, et al．Regulation of pancreatic β-cell function and mass dynamics by prostaglandin signaling[J]．Journal of Cell Communication and Signaling，2017，doi: 10.1007/s12079-017-0377-7.

Study on the Material Basis of Phlegm and Blood Stasis Syndrome in the Metabolic Syndrome Based on UPLC/Q-TOF-MS

YANG Yu-feng，XU Na，TENG Fei

(LiaoningUniverstityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110847,China)

Objective: We analyzed the changes of endogenous metabolites in serum of rats with the syndrome of phlegm and blood stasis syndrome based on UPLC/Q-TOF-MS．Methods: We used UPLC/Q-TOF-MS technology and detected small molecule metabolites in plasma and identified the differences in characteristics of metabolites and found some biomarkers，so as to identify biomarkers and its origins and metabolic pathway. Results: The identified potential biomarkers include LysoPE、Phenylalanine、Tyrosine、14-alkyl acid、Stearic acid、D- glucose、Prostaglandin B1．Conclusion: The occurrence of metabolic syndrome of phlegm and blood stasis syndrome is related to the disorder of carbohydrate, lipid and amino acid metabolism.

Phlegm and blood stasis syndrome; Metabolic syndrome; Metabolomics

辽宁省百千万人才工程培养项目(辽人社〔2014〕229号)

杨宇峰(1979-)，男(回族)，辽宁凌源人，副教授，医学博士，从事糖尿病及代谢综合征中西医结合临床与研究。

R589

B

1006-3250(2017)03-0329-03

2016-08-17