有机质谱应用于抗体类药物结构解析的研究进展

赵永强，刘 锋，桑志红，李 梅，王 娜，何 昆

(国家生物医学分析中心，北京 100850)

有机质谱应用于抗体类药物结构解析的研究进展

赵永强，刘 锋，桑志红，李 梅，王 娜，何 昆*

(国家生物医学分析中心，北京 100850)

抗体类药物因其靶向性，能够直接与目标特异结合，并且药物副作用小、毒性低，在临床上具有广阔的应用前景。质谱(MS)以其快速、高灵敏度和高分辨率成为抗体药物结构分析的重要手段，为药物的质量控制和安全性方面提供了强有力的技术支撑。该文针对快速发展的有机质谱技术在抗体类药物的氨基酸序列、高级结构以及修饰鉴定方面的应用进行了综述。

有机质谱；抗体；结构解析;综述

近年来，单克隆抗体药物进行靶向治疗得到广泛应用，并已成为一种普遍的生物治疗手段，现今美国FDA已经批准了多达20种抗体药物上市，同时，近300种单克隆抗体药物正处于研发阶段[1]。2014～2019年间，美国有4个、欧洲及其他国家有6个单抗产品专利到期，国内外大批医药厂商瞄准市场，不断扩大研发和生产规模，单克隆抗体的垄断地位也将动摇[2-3]。抗体及抗体偶联药物的完整分子量约在150 kDa，其复杂的结构极易导致不均一性，也给抗体药物的完整解析带来极大难度。国际上，美国FDA在已发布的生物仿制药指导文件中对抗体完整结构解析做了详细阐述；目前，国内仍缺乏明确的质量标准来评价和约束单抗药品市场。有机质谱作为蛋白质结构解析的强有力检测手段，应用CID/ETD/HCD等[4-6]技术依据不同的离子碎裂方式，使鸟枪法鉴定氨基酸序列的技术在蛋白质领域不断发展和完善，已成为单抗药物及其仿制药结构鉴定的必备工具。

1 抗体类生物大分子完整分子量及氨基酸序列分析的研究

20世纪80年代以来，软电离技术成为有机质谱的强大助力，尤其是基质辅助激光解吸附电离(MALDI)和电喷雾电离(ESI)在大分子蛋白检测中发挥了重大作用[7]。MALDI-TOF-MS产生单电荷离子，反射模式下检测范围为500～5 000 Da，线性模式一般检测>5 000 Da，同时随着检测蛋白分子量的增加，会表现出质量准确度和分辨率降低的情况，使峰宽和峰形无法达到满意的效果[8]。ESI-MS产生多电荷离子，谱图结果较单电荷离子复杂，但弥补了检测范围的不足，原始数据可通过软件去卷积处理[9]。Shin等[10]应用LC-MS方法对曲妥珠单抗完整蛋白及其亚基的相对分子量进行了检测，从完整蛋白水平获得了曲妥珠单抗的氨基酸全序列确认，并使氨基酸序列覆盖率达到100%；同时，糖基化分析是通过对游离的N-连接寡糖进行2-AB荧光标记后再用LC-FLR-MS方法进行检测，最后对糖基化修饰进行结构解析和确认，联合使用这些分析方法，并同时比对了3批不同批号和不同工艺的曲妥珠单抗的异同，能够有效地对抗体类药物进行日常质量检测和深度表征,同时有效控制抗体药物的质量，从而对曲妥珠单抗药物的质量控制提供了依据,为病人提供了安全可靠的生物治疗药品。

单克隆抗体的分子量大，结构复杂，目前认为仿制药必须与原研药的氨基酸序列一致才可称为仿制药，否则会被认为是一种新的抗体药物，同时仿制药需要保证安全性和有效性，要达到两个基准，对医药厂商而言非常具有挑战性[11-12]。目前，最常用的方法是采用电喷雾离子化，必要时使用离子淌度等技术增加分离效果，以及LC-MSE技术全面展示抗体完整的序列结构[13-14]。Xie等[15]对候选生物仿制药IgG1单克隆抗体的完整分子量、氨基酸序列，以及翻译后修饰进行识别和量化，利用肽图谱和数据独立采集的液质中交替的低和高碰撞能量扫描模式LC-MSE，精确鉴定生物仿制药和创新药中几个氨基酸残基的差异在重链序列之间。这些结果表明，准确完整的质量测定、糖谱分析和LC-MSE肽谱可作为一套常规工具，用于监测单克隆抗体候选生物仿制药和创新药的质量。

2 单克隆抗体药物高级结构的研究

单克隆抗体等蛋白质药物疗效的发挥取决于蛋白的高级结构，高级结构的变化可能会导致药物在治疗时产生非预期的有效性和安全性隐患[16-17]。X-射线晶体衍射[18]和核磁共振[19]是研究蛋白高级结构的传统方法，但实际上，这两种方法均有局限性，对于单克隆抗体这类分子量大、空间结构复杂的药物并不能直观完整地反映蛋白结构。

近年来，质谱技术在研究蛋白高级结构方面进入了新的领域，氢氘交换-质谱联用(HDX-MS)成为研究单克隆抗体等生物药高级结构的有力工具[20-21]。其原理是将待测样本浸入重水溶液中，蛋白的氢原子与重水的氘原子发生转换，根据交换速率的快慢对蛋白的空间构象进行评价。HDX主要应用于蛋白质构象的研究，修饰后构象动力学，折叠/重折叠，蛋白质-配体/蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白聚集[22]。Mo等[23]应用HDX-MS技术验证了蛋氨酸的氧化对IgG抗体生物学功能的影响，并提供了非常有价值的信息。这一重要研究可以协助(CQAs)评估抗体的治疗。同时，HDX-MS还可以检测到低含量的蛋氨酸氧化引起的局部构象变化。对于单克隆抗体，更多的是在多肽水平-HDX进行高级结构可比性研究，比对并定位原研药与Biosimilar、Biobetter之间高级结构的差异[24-25]。 Pan等[26]基于HDX-MS结合蛋白水平Top-down技术与多肽水平Bottom-up联用技术，使残基信息与亚基级信息形成互补，完整解析了2批次贝伐珠单抗及1批次原研药结构的一致性，结果显示重链覆盖率87%，轻链覆盖率74%，并且HDX对重、轻链检测数据显示3批样品的高级结构无明显差异。该方法也成为目前抗体药物高级结构检测的标准流程，将抽象的概念转化成数据信息既体现了其广泛的应用范围，也在空间结构细微差别的解析中体现了直观性和准确性。

3 抗体药物糖基化修饰的研究

单抗药物药效的发挥、稳定性以及免疫原性，很大程度上与翻译后修饰相关，尤其是蛋白N-糖谱在抗体药物治疗中显著影响单克隆抗体的生物学功能，并在很大程度上取决于宿主细胞的基因型和培养条件，因此会导致N-糖基化的不均一性[27-28]。作为抗体药物最主要的翻译后修饰，变异形式主要有脱岩藻糖化、唾液酸化、末端半乳糖的数目不同等[7]。由于单抗药物在生产过程中存在多种糖型及修饰位点的变化，导致不同批次生产的抗体可能会有不同的药效及体内稳定性。因此，糖型解析也成为抗体药物质量控制的一个至关重要的检测项目。

MALDI-TOF-MS被应用于早期糖型的解析中，Raquel等[29]使用正离子模式的MALDI-TOF 以及负离子模式ESI-MS 对经过PNGase-F释放的N-糖基进行了分析，通过比对脱糖前后抗体的肽质量指纹谱差异，获得了尼妥珠单抗的N-糖链结构信息。但深入研究糖结构及糖含量信息，则需依靠液相色谱-质谱联用技术。经典方法是进行2-AB荧光标记，通过荧光检测器(FLR)进行分析[30]。Shang等[31]开发了一个高效表征单克隆抗体及相关糖蛋白的方法，应用传统的PNGaes F释放糖基，2-AB标记，基于Q-TOF与HILIC技术，采用三氟乙酸代替甲酸铵为流动相条件，可实现高分辨率和高灵敏度鉴定低丰度N-糖基结构。Jefferis等[32]详细报道了重组抗体的糖基化的重要性，抗体药物属于生物大分子药物,其生物功能的发挥离不开复杂的翻译后修饰，糖基化修饰作为抗体最重要的翻译后修饰,对于抗体的生物活性和体内代谢有着重要的作用。Huang等[33]研究了液质联用技术对可变区域糖基化对抗体清除率的影响，发现20%的人免疫球蛋白的N-糖基化位点均位于C(H)2区域，利用LC-MS技术结合多种酶切的方法，明确了糖修饰的具体位置是在CDR2的重链可变位置，同时证明了双链低聚糖缺乏，半乳糖的清除率比在FV域其他结构稍快。2015年，Waters公司研发了RapiFluor-MS技术，替换2-AB荧光试剂，并将前处理时间缩短至30 min，且标记效率以及荧光信号质量均有显著提高。

抗体偶联药物(ADCs)是近年来抗肿瘤抗体药物研发的热点和潮流[34-35]。作为一种特别的翻译后修饰类型，ADC药物是将小分子细胞毒性物质通过中间连接体(MCC)偶联到单克隆抗体特定氨基酸残基上，如半胱氨酸、赖氨酸侧链氨基，通过抗体的靶向作用将细胞毒性物质作用到靶标，达到治疗作用。目前有超过40种临床用ADC药物处于研发阶段[36]。以获得FDA批准的治疗HER2阳性转移性乳腺癌药物Trastuzumab emtansine(T-DM1)[37]为例，小分子药物美登素(DM1)与连接体(MCC)由1个硫醚结构连接，形成1个修饰基团，分子量约为956.36 Da。而通常的ADC药物含有0～8个不等的小分子药物基团[38]。目前关于ADC药物结构解析的文献报道，更多是关注不同偶联异构体的完整出峰以及平均药物与抗体的偶联比例(DAR)。Marcoux等[39]应用原位离子淌度质谱(native IM-MS)准确解析了T-DM1 平均偶联药物比例及不同异构体的分布情况，从完整蛋白水平反映出该抗体偶联药物的结构信息，为抗体偶联药物的结构解析提供了技术手段。Chen等[40]对T-DM1及其仿制药完整蛋白(DAR)进行了准确解析，还对92个偶联位点(88个赖氨酸位点和4个N端位点)进行了全面解析，实际鉴定到82个偶联位点，同时比对了在不同结构域中赖氨酸偶联位点的相对强度，由此反映了偶联比率的差异。该结果为抗体偶联药物的深入研究指出了方向，并建立了评价指标。

4 展 望

单克隆抗体等生物大分子不同于常规生物药，其分子量巨大，氨基酸存在突变的几率高，并且高级结构复杂、糖基化形式不均一，尤其是抗体偶联药物制备工艺复杂，增加了结构解析的难度，诸如小分子药物偶联位点的完整解析，游离小分子药物痕量检测等均难以依靠传统或单一的检测方法来实现。同时，出于对抗体生物药安全性以及产业保护的考虑，国内外药监部门近年来也在不断完善并提升抗体药物质控标准。Chen等[40]联合中国食品药品检定研究院建立了基于ADC药物 Kadcyla®和 Adcetris®原研药与仿制药结构确证的方法，从药物完整分子量、一级结构以及偶联药物修饰等方面进行了一致性评价，综合解析了原研药与仿制药细微结构的异同。总之，为了应对日益扩大的抗体药物市场以及对药物质量控制标准的不断提高，确保临床用药的安全性，建立系统的分析平台以及形成一套基于LC-MS/MS的多项目综合解析体系已成为抗体结构解析的必然趋势。

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Research Progress on Application of Organic Mass Spectrometry in Structural Analysis of Antibody Drugs

ZHAO Yong-qiang，LIU Feng，SANG Zhi-hong，LI Mei，WANG Na，HE Kun*

(National Center of Biomedical Analysis，Beijing 100850，China)

With their targeting abilities，small sid-effects and low toxicity,antibody drugs could be directly combined with target specific，and they have broad application prospects in clinical practice.With its rapidness，high sensitivity and resolution，mass spectrometry(MS) has become an important means to analyze the structure of antibody，which provides a strong technical support for quality control and safety of the drug.In this paper，the rapid application development of organic mass spectrometry in the consistency of the amino acid sequence of antibody class，advanced structure and post translational modification(PTMs) are reviewed .

organic mass spectrometry；antibody；structural analysis;review

2016-09-28；

2016-11-09

新药创制重大专项(2014ZX09304311-001)；国家科技支撑计划(2015BAK45B01)；科技基础性工作(创新方法)专项(2012IM030300)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.008

O657.63；O629.7

A

1004-4957(2017)02-0201-04

*通讯作者：何 昆，博士，副研究员，研究方向：药物分析、蛋白质组学，Tel：010-66930306，E-mail：hk@proteomics.cn