双孢蘑菇固态发酵对燕麦多酚的影响

刘红艳，翟飞红，马茹男，韩建荣

（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

双孢蘑菇固态发酵对燕麦多酚的影响

刘红艳，翟飞红，马茹男，韩建荣

（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

初步研究了双孢蘑菇固态发酵对燕麦中游离态多酚和结合态多酚含量的影响，并采用高效液相色谱法测定了酚酸种类的变化。结果表明，燕麦经双孢蘑菇固态发酵后，游离态多酚含量从0.015 mg/g提高到5.782 mg/g，是对照的385.5倍；结合态多酚含量由0.335 mg/g减少到0.156 mg/g，是对照的46.6%；总酚含量由0.350 mg/g增加到5.938 mg/g，是对照的16.966倍。高效液相色谱法测定结果表明，经双孢蘑菇发酵后，燕麦中的酚酸种类发生了变化，且种类明显多于对照组，其中，对照组中绿原酸含量（25.43%）丰富，而发酵后的燕麦中咖啡酸含量（16.79%）丰富。

双孢蘑菇；燕麦；固态发酵；多酚

双孢蘑菇（Agaricus bisporus）在分类学上属担子菌类伞菌目伞菌科，其具有很高的营养价值[1]。研究发现，双孢蘑菇具有降低血脂、护肝、抗氧化、防癌抗癌和抑菌等广泛的药理作用[2]。对于双孢蘑菇，不仅其子实体可以被利用，其菌丝体也可以通过固态发酵等方式加以利用。

燕麦的主要成分为淀粉和蛋白质，具有多元酚结构的酚类物质也广泛存在于燕麦中，其多酚类物质不仅具有很强的清除自由基能力，还可以通过抑制氧化酶和络合过渡金属离子等方式起到抗氧化作用[3-4]。有报道表明，燕麦中的多酚主要以结合态和游离态形式存在，并且结合态多酚含量远远高于游离态多酚含量[5]。结合态多酚主要分布在皮层和糊粉层，人们在食用燕麦的过程中，结合态多酚往往不能被人体充分吸收，从而降低了对燕麦多酚的利用率。

大量研究表明，经微生物发酵以后，谷物中的大分子物质能被降解成利于人体吸收的小分子物质，提高其营养物质的利用率[6]。但关于双孢蘑菇利用燕麦进行固态发酵的研究还未见报道。

本试验选用燕麦作为培养基，初步研究了双孢蘑菇固态发酵对燕麦多酚含量的影响，并对发酵后多酚的成分进行了初步鉴定，旨在为提高谷物营养价值提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 菌种

双孢蘑菇（Agaricus bisporus）2796菌株，由山西大学生命科学学院微生物实验室提供，保存于马粪琼脂培养基中。

1.2 试剂

没食子酸、福林酚、3，5-二硝基水杨酸（DNS）、甲醇、浓盐酸、氢氧化钠、乙酸乙酯、碳酸钠、酒石酸甲钠、石油醚、可溶性淀粉，均为国产分析纯；原儿茶酸、龙胆酸、咖啡酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、p-香豆酸、阿魏酸、芥子酸、水杨酸、肉桂酸，均为高效液相色谱纯。

1.3 仪器

TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；电子天平，上海精密科学仪器有限公司；SC-3614低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；台式全温振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；HHS型电热恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；GZX-9076MBE电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；Waters高效液相色谱仪配Waters 2487泵和Waters 2526紫外检测器，上海铂力生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 燕麦培养基的制备 准确称取800 g（干质量）除去谷壳和石子等杂物的燕麦，在100℃沸水中煮沸至无白心，沥干水分，摊开晾干至不黏手（水分含量大约为40%）。然后，将处理好的燕麦平均分装在16个250 mL的锥形瓶中，用透气塑料膜封口，121℃灭菌1 h。

1.4.2 固态发酵 将活化后的双孢蘑菇斜面菌种切成1 cm×1 cm的小块，接种至灭菌后的燕麦培养基中，每瓶接种3块，置于25℃培养箱中培养，待菌丝长满瓶后开始计时，分别在满瓶后第5，10，15，20，30天后取出。取出的样品用玻璃棒搅拌均匀，部分用来直接测定碳水化合物水解酶的酶活；部分在40℃烘箱中烘干并粉碎过0.177 mm筛，用来测定发酵产物的多酚含量及组成。每个处理做3个重复，以不接种的培养基作为对照。

1.4.3 发酵产物多酚的提取

1.4.3.1 游离态多酚的提取 按照CHETHAN等[7]的方法，略作改动。分别准确称取5 g烘干并粉碎的样品，用石油醚（30～60）脱脂，加入50 mL 1%HCl-甲醇提取剂，在摇床上振荡提取24 h（25℃，150 r/ min）。然后，4 000 r/min离心10 min，取上清。采用相同方法重复提取2次，并合并上清液。将所得提取液45℃旋转蒸发至干，并用甲醇定容至一定体积，即为游离态多酚提取液。

1.4.3.2 结合态多酚的提取 将1.4.3.1所得残渣40℃烘干后加入20 mL NaOH溶液（2 mol/L），25℃摇床150 r/min振荡1 h，然后用浓HCl调pH值至2，加入15 mL乙酸乙酯，静置10 min，4 000 r/min离心6 min，收集乙酸乙酯部分，45℃旋转蒸发至干，最后用甲醇定容至10 mL，即为结合态多酚提取液。

1.5 测定项目及方法

1.5.1 发酵产物多酚含量的测定 采用Folin-Ciocalteu比色法[8]测定多酚的含量。标准曲线的绘制采用没食子酸，根据没食子酸的浓度和OD值来绘制标准曲线，得到的标准曲线的线性回归方程为：y＝7.157 5x－0.003 5（R2＝0.999 8）。多酚含量以mg没食子酸/g燕麦（干质量）来表示（文中单位均表示为mg/g）。

1.5.2 发酵产物多酚种类的测定 采用HPLC法测定发酵后燕麦中游离态多酚的组成成分。具体HPLC条件等参考CHETHAN等[7]的方法，高效液相系统：Waters 1525泵、Waters 2487双波长吸收检测器，用C18反相色谱柱（Venusil XBP C18（L）5 μm，150Å，250 mm×4.6 mm），紫外检测波长295 nm，样品过0.45μm的滤器，进样量20μL，流速1.0 mL/min，柱温为25℃；色谱条件：流动相A为0.01%的乙酸，流动相B为甲醇（色谱纯）。洗脱梯度程序：0 min（80%A＋20%B），0～40 min（60%A＋40%B），40～50 min（60%A＋40%B），50～55 min（80%A＋20%B），55～65 min（80%A＋20%B）。

样品色谱图出峰时间与标准品出峰时间作比较，分析对照组与发酵后燕麦中游离态多酚种类的变化。

1.6 统计学分析

数据用SPSS 18.0软件Duncan多重比较法[9]进行多个均值间的两两比较。

2 结果与分析

2.1 发酵产物多酚的含量

从图1可以看出，燕麦经双孢蘑菇固态发酵后，随着发酵时间的延长，游离态多酚含量逐渐增加，结合态多酚含量逐渐减少，总酚含量逐渐增加。未经双孢蘑菇固态发酵的燕麦，游离态多酚含量为0.015 mg/g，结合态多酚含量为0.335 mg/g，结合态多酚含量远高于游离态多酚含量，且结合态多酚含量为游离态多酚含量的22倍；当发酵时间为30 d时，游离态多酚含量达最高值，为5.782 mg/g，结合态多酚含量达到最少值，为0.156 mg/g，总酚含量为5.938 mg/g，其中，游离态多酚含量是对照的385.5倍，结合态多酚含量是对照的46.6%，总酚含量是对照的16.966倍。

2.2 发酵产物多酚种类的测定

选取12种谷物中最常见的酚酸作为标准品，进行HPLC分析，其色谱图如图2所示。

如图3所示，通过和图2中的12种标准品色谱出峰时间进行对比，对照组燕麦中的游离态多酚的HPLC图谱中有5种峰可以被确定，分别为绿原酸、对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸和肉桂酸。由表1可知，对照组燕麦中，绿原酸的峰面积占总酚峰面积的比例最大（25.43%），即对照组燕麦中的绿原酸含量较丰富。

表1 发酵前后燕麦不同种类酚酸的相对峰面积 %

如图4所示，发酵后燕麦中的游离态多酚的HPLC图谱出峰数明显多于对照组，与图2中的12种标准品出峰时间比对发现，有7种峰可以被确定，除了对照组中的对羟基苯甲酸和香草酸之外，还检测出了原儿茶酸、咖啡酸、p-香豆酸、芥子酸和龙胆酸。由表1可知，发酵后的燕麦中，咖啡酸的峰面积占总酚峰面积的比例最大（16.79%），即发酵后的燕麦中咖啡酸含量较丰富。

结合图3，4可以看出，经双孢蘑菇固态发酵后，对照组中的绿原酸、阿魏酸和肉桂酸并未检测出，检测出了新的龙胆酸、咖啡酸、p-香豆酸和芥子酸。猜想可能在发酵过程中发生了某些生物化学反应，使燕麦中游离态多酚的种类发生了变化。此外，表1结果表明，经双孢蘑菇固态发酵后，燕麦中各酚酸的比例也发生了变化，如对照组中的香草酸仅为0.32%，经双孢蘑菇发酵后，其比例变为2.59%。结果表明，双孢蘑菇固态发酵不仅提高了燕麦的多酚含量，也增多了酚酸的种类，而且各酚酸的比例也得到了改变。从图3，4还可以看出，对照组和发酵后的HLPC色谱图中，仍有很多含量很高却无法被确定的酚酸存在，所以，下一步将采用高效液相分步收集各组分，并采用核磁共振结合高效液相-质谱联用技术来分析这些发酵后产生的未知新物质。

3 结论与讨论

本研究结果表明，燕麦经双孢蘑菇固态发酵后，随着发酵时间的延长，游离态多酚含量逐渐增加，结合态多酚含量逐渐减少，总酚含量逐渐增加。经双孢蘑菇固态发酵后，燕麦的游离态多酚含量增加了5.767 mg/g，而其结合态多酚含量仅降低了0.179 mg/g，表明其游离态多酚含量的增加要远高于结合态多酚含量的减少。LIU等[10]研究结果表明，双孢蘑菇的子实体中富含多酚，且其多酚含量会受到栽培条件和周围环境等的影响。在固态发酵过程中，双孢蘑菇代谢会产生多酚，使得燕麦发酵产物中的游离态多酚含量提高。

目前，BHANJA等[11]用2种丝状真菌米曲霉（Aspergillus oryzae）和泡盛曲霉（Aspergillus awamori）来发酵小麦，研究了发酵后小麦的总酚含量和抗氧化性，结果表明，小麦经这2种丝状真菌固态发酵后总酚含量及抗氧化性显著提高，其中，总酚含量从未发酵时的7.226 μmol/g提高到158.192 μmol/g；此外，还对发酵体系中的α-淀粉酶、β-葡糖苷酶和纤维素酶等碳水化合物水解酶的酶活进行了测定，并对这些酶活与多酚含量之间的相关性进行了分析，结果表明，碳水化合物水解酶的酶活与多酚含量之间有一定的正相关性，表明碳水化合物水解酶在释放结合态多酚中起到了一定的作用。双孢蘑菇可以分泌一些碳水化合物水解酶来分解大分子物质，以提供生长过程中所需的能量[12]。在本试验中，发酵后燕麦中结合态多酚含量的减少，可能是由于碳水化合物水解酶引起了结合态多酚释放。MOORE等[13]使用酵母发酵麦麸，研究发现，麦麸中的酚酸及总酚含量显著增加，其清除自由基能力明显提高。LEE等[14]用各种安全的丝状真菌，包括泡盛曲霉（A.awamori）、米曲霉（A.oryzae）、酱油曲霉（Aspergillus sojae）和根曲霉（Rhizopus azygosporus）等发酵黑豆，研究发酵前后黑豆抗氧化能力的变化，结果表明，发酵后黑豆中多酚含量显著上升，抗氧化能力得到改善。表明豆类经丝状真菌或酵母类真菌固态发酵后，其多酚含量和抗氧化作用都有了显著提高。本试验结果也表明，利用双孢蘑菇固态发酵后，多酚含量得到了显著提高。

双孢蘑菇子实体也具有治疗高血压和肝炎等功效[15]，很多研究表明，双孢蘑菇子实体与菌丝体具有相同的功效，并且有的菌丝体要优于子实体。翟飞红等[16]利用双孢蘑菇菌丝体进行液态发酵，对所得到的菌丝体的抗氧化性和多糖含量进行分析，结果表明，双孢蘑菇菌丝体具有很强的抗氧化活性，且含有丰富的多糖。可能是由于固态发酵过程中会发生很多生物化学变化，会分泌一些有益的小分子物质，除此之外，微生物中含有丰富的酶系，在发酵过程中会产生新的代谢产物[6]。

一般固态发酵都会采用酵母菌如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和泡盛曲霉（A.awamori）、米曲霉（A.oryzae）及根曲霉（R.azygosporus）等霉菌，利用食用真菌对谷物进行固态发酵，研究的人还很少。所以，在研究双孢蘑菇固态发酵对多酚含量影响的情况下，其抗氧化作用还有待研究，并对其发酵后产生的其他营养物质进行深入分析。

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Effect of Solid-state Fermentation of Agaricus bisporus on Polyphenols Content of Oats

LIUHongyan，ZHAI Feihong，MARunan，HANJianrong

（College ofLife Science，Shanxi Univeisity，Taiyuan 030006，China）

In this paper,the effect of solid-state fermentation with Agaricus bisporus on free polyphenol and bound polyphenol of oats were studied.The polyphenol species and the three kinds of hydrolytic enzymes（α-amylase,β-glucosidase and xylanase）were measured.The results showed that the contents of free polyphenol and total phenols increased after solid-state fermentation and varied with the prolonging of fermentation time.The contents of free polyphenol increased from 0.015 mg/g to 5.782 mg/g and the contents of total phenols increased from 0.350 mg/g to 5.938 mg/g,while the bound polyphenol content of fermentation products decreased from 0.335 mg/g to 0.156 mg/g.The results of HPLC indicated that the kinds of phenolic acid had a great change after fermentation.The chlorogenic acid（25.43%）in non-fermented oats and the caffeic acid（16.79%）in fermentation products was abundant,respectively.

Agaricus bisporus;oats;solid-state fermentation;polyphenol

S646.1＋1

A

1002-2481（2017）03-0361-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.03.11

2016-11-03

山西省煤基重点科技攻关项目（FT2014-03-15）

刘红艳（1990-），女，山西交城人，在读硕士，研究方向：资源微生物。韩建荣为通信作者。