硼对根瘤菌在紫花苜蓿体内运移和定殖及对幼苗生长的影响

苗阳阳，周彤，师尚礼，康文娟,张运婷(甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，甘肃省草业工程实验室，中-美草地畜牧业可持续研究中心，甘肃 兰州730070)



硼对根瘤菌在紫花苜蓿体内运移和定殖及对幼苗生长的影响

苗阳阳，周彤，师尚礼*，康文娟,张运婷
(甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，甘肃省草业工程实验室，中-美草地畜牧业可持续研究中心，甘肃 兰州730070)

通过向青色荧光蛋白(CFP)标记的两种根瘤菌菌液EnsifermelilotiLZgn5f (gn5f) 和Ensifermeliloti12531f (12531f)内添加不同浓度硼并接种于苜蓿幼苗根部，研究硼对荧光标记根瘤菌在甘农5号紫花苜蓿幼苗体内运移和定殖的动态变化及接种对苜蓿幼苗生长的影响。结果表明，添加1 mg/L硼较利于12531f生长， 100 mg/L硼较利于gn5f生长。添加适宜浓度硼对苜蓿幼苗体内荧光标记根瘤菌运移和定殖具有促进作用，两种荧光标记根瘤菌在根部定殖数量较多，其中添加100 mg/L硼15 d时根部12531f数量最高，达2184.99 cfu/g，添加0.5 mg/L硼60 d时gn5f数量最高，达58307.11 cfu/g；同时可向地上运移，主要运移并定殖于下部茎叶内，1 mg/L硼利于12531f在下部茎叶内定殖，100 mg/L硼利于gn5f在下部茎内定殖。对照各部位未检测到两种荧光标记根瘤菌。添加硼处理的单株结瘤数、单株根瘤重、单株叶片数、株高、根长、地上鲜重、地上干重、根鲜重和根干重均高出对照和单独接菌处理，1 mg/L硼+12531f处理高出对照和单独接菌处理，范围在21.31%～909.28%之间；100 mg/L硼+gn5f处理高出对照和单独接菌处理，范围在15.07%～1424.24%之间；虽然单独接种12531f抑制了叶绿素的形成，但添加1 mg/L硼后其含量则升高，分别显著高出对照和单独接菌处理18.31%和36.86%(P<0.05)，而接种gn5f则促进了叶绿素的合成，添加100 mg/L硼后含量分别显著高出对照和单独接种处理24.41%和12.92%(P<0.05)。因此，1 mg/L硼与12531f混合接种，100 mg/L硼与gn5f混合接种对根瘤菌在苜蓿幼苗体内运移和定殖及对幼苗的生长具有促进作用，为苜蓿种植提供了依据。

荧光标记根瘤菌；硼；紫花苜蓿；运移和定殖；促生效应

紫花苜蓿(Medicagosativa)是一种多年生优质豆科牧草，以其耐干旱、耐贫瘠、品质好、经济价值高等特性被誉为“牧草之王”[1]。适量施用化肥可提高苜蓿产量，改善品质，但长期施用会使环境污染，土壤条件恶化，并对生态系统造成严重危害[2]。根瘤菌可与豆科植物共生形成根瘤，并在植物根部结瘤固氮，将大气中的无机氮转化为植物可以吸收利用的有机氮，还可以内生菌的形式存在于植物组织中形成特殊的微生境[3]。已有的研究表明，苜蓿接种根瘤菌可促进结瘤，提高固氮能力，是提高产量和品质的重要措施[4-5]。苜蓿播种时进行根瘤菌接种已在美国、加拿大和澳大利亚等国家普遍使用[6-8]，主要的接种方法为施用根瘤菌菌剂拌种或包衣种子，但接种效果并不稳定[9]，作物种类与根瘤菌种类及外在特殊的自然环境、接种方法与土著根瘤菌的竞争及多种生物与非生物的胁迫均可影响接种根瘤菌的结瘤能力，使部分根瘤菌难以高效地与豆科植物结瘤固氮，难以达到应有的增产效果[10-11]。因此如何提高根瘤菌的接种效果对苜蓿生产具有重要意义。

大量微生物可以定殖于植物根际，有些还可以内生菌的形式定殖于植物体内并进行大量繁殖[12-13]。根瘤菌能否成功侵染植物根部成为根瘤菌剂接种效果的一个主要因素。而与外源菌相比，内生菌在竞争结瘤方面有明显优势，因此在豆科植物高成本的接种背景下对内生菌的研究就具有较强的理论与实践意义。近年来，已有大量关于健康植物组织内生菌的分离、鉴定及定殖过程的研究[14-15]，且发现具有抗病虫害、促进植物生长、提高固氮能力的作用[14-18]。已发现内生根瘤菌可定殖于苜蓿、烟草(Nicotianatabacum)、水稻(Oryzasativa)等植物体内[19-21]，但内生根瘤菌在种子及植株体内的分布不是恒定的，会受土壤养分、温度、水分及田间管理、种子保存时间、供试植物材料、菌株遗传特性等因素影响[11,21-24]。有关内生根瘤菌在植物体内的运移途径、动态变化、定殖部位及对种子和植物组织内微生物群落影响的研究较少。陈丹明等[25]首次发现苜蓿种子内携带有根瘤菌。李剑峰等[21-22]和张淑卿[23]发现苜蓿内生根瘤菌主要存在于根系的毛根，同时大量存在于与种子形成的有关部位。在苜蓿芽苗、幼苗及田间营养生长阶段，苜蓿各组织内均有内生根瘤菌的存在，但因侵染宿主根部后向地上部位迁移时会遇到阻碍或屏障导致定殖数量减少。通过添加LaCl3、生长素(IAA)、胞外多糖等外源物质可以减弱根瘤菌在苜蓿体内运移与定殖时遇到的防御反应，从而提高了根瘤菌在苜蓿各组织内的定殖数量[22]。

研究发现，适量硼可增加苜蓿单株结瘤数、提高种子产量并改善营养品质[26-29]。由此可见硼在提高根瘤菌固氮效率、增加作物产量、提高蛋白质含量方面已表现出一定效果。硼可促进IAA合成，利于其在植物组织内的扩散和运输[30]。而IAA能增大细胞壁膜透性，促进养分的释放与根系根瘤菌的侵染，同时降低植物防卫系统的胞壁降解酶的活性，使入侵微生物易于定殖在植物组织内[22,31-32]。

近年来有关硼对根瘤菌影响的研究主要集中在结瘤效率和促进作物生长方面，而关于硼对根瘤菌在苜蓿体内运移和定殖影响的研究尚未报道。因此，本试验通过添加不同浓度硼来研究其对荧光标记根瘤菌在苜蓿体内运移和定殖及对苜蓿幼苗生长的影响，为提高接种效果，促进大量内生根瘤菌定殖于植物体内并向繁殖器官转移，形成携带目的根瘤菌的种子提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试根瘤菌：由草业生态系统教育部重点实验室提供的荧光标记根瘤菌Ensifermeliloti12531f (12531f)和EnsifermelilotiLZgn5f (gn5f)。其原始菌株分别为Ensifermeliloti12531f(购自中国科学院微生物保藏中心——分离自非本苜蓿植株体内的外源根瘤菌)，EnsifermelilotiLZgn5 (gn5)(分离自甘农5号紫花苜蓿种子的内源根瘤菌，经中国科学院微生物鉴定保藏中心测序鉴定)，其最终来源是上代苜蓿植株的内生根瘤菌，通过垂直传代进入种子。所有菌种于TY(Yeast Tryptone Agar)固体穿刺管中[33]4 ℃保存后以三亲本杂交法导入青色荧光蛋白质粒标记构建标记菌株待用[34]。

供试苜蓿种子：甘肃农业大学教育部草业生态系统重点实验室提供甘农5号紫花苜蓿(MedicagosativaGannong No.5)种子，净度为97%，发芽率为84%。

供试硼：购自于兰州博域生物科技有限责任公司的硼酸，含量不少于99.5%。

培养基：采用TY培养基进行菌种的保存、活化、培养及苜蓿各组织内荧光标记根瘤菌数量的检测。配方为胰蛋白胨:5 g；酵母粉:3 g；CaCl2·6H2O:1.3 g；蒸馏水1000 mL；pH:7.0；121 ℃高温灭菌26 min；固体培养基加琼脂15 g/L。

营养液：Hoagland有氮营养液[35]和Hoagland无氮营养液[36]，以1 mol/L的NaOH溶液或1 mol/L HCl溶液调节营养液pH=7.0±0.1。

1.2 试验方法

1.2.1 硼浓度筛选及培养基的制备 设置硼酸浓度为0、0.01、0.5、1、10和100 mg/L。硼酸置于无菌三角瓶中，无菌操作台内紫外杀菌1 h后无菌水溶解并过无菌滤膜(直径0.22 μm)3次，尔后按需要的浓度加入配制好的40 mL TY液体培养基中。

1.2.2 荧光标记根瘤菌菌液制备 将TY固体穿刺管保存的两种荧光标记根瘤菌活化后接入50 mL TY液体培养基，28 ℃、180 r/min培养至OD600 nm=0.5～0.8，将该菌液按10%浓度加入不同硼浓度的液体培养基内。待上述培养基培养至OD600 nm=0.5～0.8后将其转移至50 mL无菌离心管中，8000 r/min离心10 min，弃上清，留沉淀，加入等体积的无菌水，在涡旋振荡器上充分打散，制成菌悬液待用。

1.2.3 苜蓿幼苗的培养及接种 试验于2014年4月在甘肃农业大学温室内进行。选取健康饱满的甘农5号紫花苜蓿种子，置于已灭菌的50 mL三角瓶内，碘伏(购自兰州博域生物科技有限责任公司，有效碘含量0.45%～0.55%)浸泡3 min，无菌水清洗4次，每次1 min。以上操作均在无菌操作台内进行。

细沙洗净150 ℃高温持续烘干5 h后121 ℃灭菌26 min，连续灭菌5次，待冷却后装入75%乙醇消毒且杯底扎有网眼的塑料杯(直径6.0 cm、高7.5 cm， 400 g/杯)，将其放入水培盒中(长31 cm，宽19 cm，高10.5 cm)。每杯播种40粒已消毒的种子，表面覆盖干沙2 cm左右。未接种荧光标记根瘤菌液前，每处理水培盒内加700 mL Hoagland有氮营养液，使其由杯底自下而上浸湿[37]。

待苜蓿幼苗长出真叶后，每杯定苗25株，将已制好的1.2.2菌悬液浇于盆栽表面，25 mL/杯。每处理重复6次，以无菌蒸馏水接种处理为对照。幼苗生长过程中用无菌蒸馏水补充水分，接种后每15 d浇灌500 mL/盒 Hoagland无氮营养液，至60 d幼苗收获。按表1设置试验处理。

表1 试验处理Table 1 Treatments for experiment

1.3 测定指标与方法

1.3.1 荧光标记根瘤菌生长的测定 于接种后1、3、5和7 d的相同时间测定含不同浓度硼的培养基菌液OD600 nm吸光度值。

1.3.2 荧光标记根瘤菌在苜蓿体内运移和定殖的测定 接种后每隔15 d取样，每处理每重复内随机选取幼苗，分为上部茎、上部叶、下部茎、下部叶和根；分别称取1 g置于50 mL无菌三角瓶内，碘伏浸泡3 min，无菌水冲洗4次，每次1 min。各组织消毒后，将最后一次消毒的植物组织各面在固体培养基平板上放置30 min后取出，将平板28 ℃条件下培养24～48 h，未长出菌落，表明已彻底消毒[20]。将完全消毒后的组织分别置于无菌研钵中加入2 mL无菌水研磨(重量低于0.5 g则加入1 mL无菌水)(根部研磨液依次稀释为10、102、103倍，其他组织不稀释)，离心(4000 r/min，3 min)后依次吸取0.2 mL均匀涂布于TY固体培养基中，28 ℃培养24～48 h，计数每皿内菌落数量。黑暗条件下用手提紫外灯观察每皿内发光的荧光标记根瘤菌菌落个数后换算出每克样品(鲜重)内荧光标记根瘤菌数量[22]。

1.3.3 单株结瘤数和单株根瘤重的测定 幼苗生长60 d后每处理随机取5株测定单株结瘤数和单株根瘤重。

1.3.4 形态指标的测定 幼苗生长60 d后每处理每重复随机选取5株计算单株复叶数、刻度尺测量株高及根长。同时每处理随机选取10株，称取地上和根部鲜重(滤纸吸干表面水分)和干重(烘箱中105 ℃杀青20 min，尔后80 ℃烘干至恒重)[38]。

1.3.5 叶绿素含量的测定 幼苗生长60 d后每处理随机选取叶片，用脱脂棉擦拭干净，去除主脉和两头部分，剪碎，混匀，称0.2 g左右，用99%丙酮和95%乙醇1∶1混合液定容50 mL，重复3次。将定容好的容量瓶置于黑暗处，每天摇动1次，直至叶片完全变白，记录吸光度值(OD645 nm、OD663 nm)[39]。

1.4 数据处理

利用Excel 2007整理数据并作图，采用SPSS(SPSS V16.0，SPSS Inc.， Chicago， IL，USA)软件进行处理和方差分析，采用Duncan新复极差法进行各个处理的多重比较。

2 结果与分析

2.1 硼对荧光标记根瘤菌生长的影响

适宜硼浓度对两种荧光标记根瘤菌的生长具有促进作用(图1)。1至5 d时，硼对12531f的生长无明显促进作用；7 d时，当硼浓度低于1 mg/L时其生长速度高于未添加硼处理，且添加1 mg/L硼时其生长速度最高，显著高于未添加硼处理(P<0.05)，硼浓度高于1 mg/L后，生长速度降低，与对照差异不显著(P>0.05)(图1A)。

1 d时，随着硼浓度的增加，gn5f的生长速度逐渐增大，当浓度达100 mg/L时，gn5f生长速度最快，显著高于其他处理(P<0.05)；3 d时，硼浓度低于1 mg/L时，gn5f生长速度显著低于对照(P<0.05)，其余处理与对照差异不显著(P>0.05)；5和7 d时，除添加0.01 mg/L硼处理生长速度低于未添加硼处理外，其余各处理同样与对照差异不显著(P>0.05)(图1B)。

表明硼对两种不同来源的荧光标记根瘤菌生长促进作用不同，其中1 mg/L硼对12531f生长稍有促进作用，而100 mg/L硼对gn5f生长初期效果较好，随着时间的延长则无明显作用。

图1 硼对12531和gn5f生长的影响变化Fig.1 Effect of boron on the growth of 12531f and gn5f A：硼对12531f 的影响Effect of boron on the growth of 12531f；B：硼对gn5f的影响Effect of boron on the growth of gn5f.不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。 The different small letters mean the significant differences at P<0.05, the same below.

2.2 硼对荧光标记根瘤菌在苜蓿根内定殖的影响

如表2所示，添加1、10和100 mg/L硼接种12531f后，根部可检测到荧光标记根瘤菌。添加100 mg/L硼15 d时根部12531f数量最多，达2185.00 cfu/g，但与1 mg/L硼接种45 d处理无显著差异(P>0.05)；30 d时数量减少，45 d后数量又逐渐升高。1 mg/L硼处理菌落数量显著高于同时期其他处理(P<0.05)，菌落数量在1494.27～2001.40 cfu/g范围内波动。未添加硼处理和对照均未检测出12531f。

不同硼浓度对gn5f在苜蓿根部运移及定殖影响不同，15 d时，添加0.01、0.5和1 mg/L硼后根内可检测出gn5f，但三者之间差异不显著(P>0.05)；30 d时其在根内定殖数量减少，45 d后开始升高，60 d时根内定殖数量最高；添加0.5 mg/L硼后根内gn5f数量最高，达58307.11 cfu/g，但与1 mg/L硼处理差异不显著(P>0.05)。未添加硼处理和对照均未检出gn5f。

由此表明，两种荧光标记根瘤菌均可以长时间在根部定殖，但硼对二者定殖的影响不同。100 mg/L硼利于12531f定殖于根部，0.5 mg/L硼利于gn5f定殖于根部。

2.3 硼对荧光标记根瘤菌在苜蓿地上各组织内运移和定殖的影响

如表3所示，添加硼后促进了12531f向下部叶和下部茎内运移并定殖，添加1 mg/L硼显著提高了12531f在下部叶内的定殖数量，接种15 d时数量最高，达23.38 cfu/g，显著高于其他处理(P<0.05)；45 d时同样发现1 mg/L硼促进了12531f在下部叶内的定殖，数量达11.04 cfu/g。下部茎较利于12531f定殖， 45 d时添加1 mg/L硼数量高达62.74 cfu/g，与单独接菌处理差异显著(P<0.05)。上部茎内，单独接种15 d时可检测到12531f，数量为17.81 cfu/g，其余处理未检测到。上部叶内未检测到12531f。60 d后检测不到12531f。对照未检测出12531f。

硼较适宜gn5f定殖于下部茎，接种15和30 d时，100 mg/L硼显著提高了gn5f的定殖数量，数量分别高达57.55和51.49 cfu/g，显著高于其他处理(P<0.05)，45 d后数量逐渐减少，60 d后检测不到gn5f。硼对gn5f在苜蓿下部叶和上部茎叶内的运移和定殖影响较小，只有在添加0.5 mg/L硼处理15 d时下部叶内检测到少量gn5f，数量仅为2.65 cfu/g，其余处理未检测到。未添加硼处理的单独接菌处理和对照未检测到gn5f。

12531f在下部茎内定殖45 d时数量最高，而gn5f在15 d时定殖数量达最高，以后数量逐渐降低，由此表明两种荧光标记根瘤菌在苜蓿地上表现出不同的运移及定殖规律，受菌种来源及遗传特性决定。

表2 硼对12531f和gn5f在苜蓿根内运移与定殖的影响Table 2 Effect of boron on the migration and colonization of 12531f and gn5f in alfalfa roots cfu/g

注：表中数据为平均值±标准误，同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

Note: Values (mean±SE) represent the results of Duncan’s multiple range test, the different letters in the same column indicate significant differences (P<0.05), the same below.

2.4 硼和荧光标记根瘤菌接种对甘农5号紫花苜蓿单株结瘤数及根瘤重的影响

适宜浓度的硼和两种荧光标记根瘤菌接种苜蓿幼苗有增加单株结瘤数和单株根瘤重的趋势，但作用不明显(表4)。1 mg/L硼和12531f接种后苜蓿单株结瘤数分别高出对照和单独接菌处理21.32%和30.95%，但差异不显著(P>0.05)；单株根瘤重分别高出对照和单独接菌处理34.67%和176.71%，但差异不显著(P>0.05)。其余硼浓度与12531f混合接种后对单株结瘤数和单株根瘤重无明显促进作用。

低浓度硼与gn5f混合接种后未提高单株结瘤数，硼浓度低于1 mg/L时，单株结瘤数低于对照和单独接菌处理，添加10和100 mg/L硼后单株结瘤数增加，100 mg/L硼处理下数量最高，分别高出对照和单独接菌处理23.53%和15.07%，但差异不显著(P>0.05)。单株根瘤重仅在添加100 mg/L硼时高于对照，分别高出对照和单独接菌处理21.67%和117.26%，同样与对照差异不显著(P>0.05)。

表明只有在适宜硼添加浓度下接种才可促进苜蓿根瘤的形成，且不同来源的根瘤菌要选择不同的硼浓度。

2.5 硼和荧光标记根瘤菌接种对甘农5号紫花苜蓿幼苗生长的影响

两种荧光标记根瘤菌接种后苜蓿幼苗单株叶片数、株高和根长均增加，添加硼后三者均高于未添加硼的单独接菌处理和对照(表5)。硼与12531f混合接种后，随硼浓度的增加，三者均逐渐增大，添加1 mg/L硼后达最高，单株叶片数分别显著高出对照和单独接菌处理89.70%和84.12%(P<0.05)；株高分别显著高出对照和单独接菌处理133.93%和117.13%(P<0.05)；根长分别高出对照和单独接菌处理175.00%和63.64%，但与单独接菌处理无显著差异(P>0.05)；尔后随硼浓度的增加，单株叶片数、株高和根长逐渐减小。硼与gn5f混合接种后单株叶片数、株高和根长逐渐增加，添加100 mg/L后各指标均达到最大，其中单株叶片数分别显著高出对照和单独接菌处理45.45%和37.93%(P<0.05)；株高分别显著高出对照和单独接菌处理69.64%和37.68%(P<0.05)；根长分别高出对照和单独接菌处理95.83%和17.50%，但与单独接菌处理无显著差异(P>0.05)。

表3 硼对12531f和gn5f在苜蓿地上各组织内运移和定殖的影响Table 3 Effect of boron on the migration and colonization of 12531f and gn5f in alfalfa aerial tissues cfu/g

表4 硼和12531f、gn5f混合接种后甘农5号紫花苜蓿单株结瘤数及根瘤重Table 4 Effect of boron and 12531f, gn5f co-inoculation on the Gannong No.5 alfalfa nodule number and nodule weight

两种荧光标记根瘤菌接种后均可增加苜蓿幼苗生物量，添加适宜浓度硼后生物量均高于对照和单独接菌处理(表6)。硼与12531f接种后，随着浓度的升高，生物量逐渐增加，到1 mg/L硼后地上鲜干重和根鲜干重均达最高，其中，地上鲜重分别显著高出对照和单独接菌处理129.73%和80.70%(P<0.05)；地上干重分别显著高出对照和单独接菌处理172.14%和164.02%(P<0.05)；根鲜重分别显著高出对照和单独接菌处理645.05%和395.19%(P<0.05)；根干重分别显著高出对照和单独接菌处理909.28%和810.70%(P<0.05)；尔后生物量逐渐降低，但均高于对照。与gn5f接种后，随着硼浓度的升高，苜蓿生物量逐渐增加，至浓度达100 mg/L后，地上鲜干重和根鲜干重均达最高，其中，地上鲜重分别显著高出对照和单独接菌处理64.38%和36.91%(P<0.05)；地上干重分别显著高出对照和单独接菌处理148.86%和144.25%(P<0.05)；根鲜重分别显著高出对照和单独接菌处理757.57%和587.20%(P<0.05)；根干重分别显著高出对照和单独接菌处理1424.24%和1268.98%(P<0.05)。

表5 硼和12531f、gn5f接种后甘农5号紫花苜蓿单株叶片数、株高和根长Table 5 Effect of boron and 12531f, gn5f co-inoculation on the Gannong No.5 alfalfa seedlings leaf number, plant height and root length

表6 硼和12531f、gn5f接种对甘农5号紫花苜蓿生物量的影响Table 6 Effect of boron and 12531f, gn5f co-inoculation on the Gannong No.5 alfalfa seedlings biomass

2.6 硼和荧光标记根瘤菌接种对甘农5号紫花苜蓿叶绿素含量的影响

不同浓度硼与两种荧光标记根瘤菌混合接种对苜蓿叶片叶绿素含量影响不同(图2)。单独接种12531f时叶片叶绿素(a+b)含量低于对照，只有添加1 mg/L硼后其含量显著高出对照，此浓度下含量分别显著高出对照和单独接菌处理18.31%和36.86%(P<0.05)，随后含量又降低(图2A)。而单独接种gn5f时叶绿素含量显著高出对照10.17%(P<0.05)，添加低浓度硼不利于叶绿素的合成，随着硼添加浓度的增加，其含量逐渐增大，当添加100 mg/L硼后达最高，显著高出对照和单独接种处理24.41%和12.92%(P<0.05)(图2B)。

图2 硼和荧光标记根瘤菌混合接种后甘农5号紫花苜蓿叶片叶绿素含量的变化Fig.2 Variation of Gannong No.5 alfalfa leaf chlorophyll content after boron and fluorescent tagged rhizobia co-inoculation A：硼和12531f 接种Boron and 12531f co-inoculation；B：硼和gn5f接种Boron and gn5f co-inoculation.

3 讨论

3.1 硼对两种荧光标记根瘤菌在苜蓿幼苗体内运移和定殖的影响

硼是植物生长发育和稳定根瘤细胞壁结构所必需的微量元素[40-41]。根瘤菌与植物间相互作用[42]、侵染[43]、共生体的形成[44-45]、根瘤的形成[46]都会因硼的缺乏而受到极大影响。硼对根瘤菌表面多糖的形成、共生关系的建立、高效固氮作用的发挥具有重要意义。缺硼会减弱根瘤菌的定殖能力、减少根瘤的数量并削弱固氮能力[42, 47]，同时也会降低根瘤菌表面多糖的形成和其功能的发挥[48]。

硼参与根瘤菌胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的形成，而EPS和LPS对根瘤菌侵染植物时所遇到的防御反应具有减弱作用。EPS可分泌到细胞表面，并抵御外来侵害[49-50]，是参与共生固氮的重要物质。当根瘤菌侵染宿主时会使宿主产生防御反应，而EPS可通过表面包被减少菌体与宿主细胞的直接接触，以规避或减弱宿主植物的防御性反应，促成根瘤菌的侵入和根瘤的形成；或在侵染过程中诱导菌体和宿主合成水解酶，引起宿主胞壁的结构变化[51]。LPS在细胞壁外壁，可维持细胞膜稳定、抵御植物抗菌素对细胞的伤害[52]， LPS对根毛的吸附、侵染结构及根瘤的形成，对细胞抵御植物防御反应以及根瘤菌的宿主专一性等方面都起到重要的作用。硼同样可促进IAA的合成，宋柏权等[30]发现当硼浓度逐渐增到2 mg/L时，甜菜叶片内IAA含量达最高，随着硼浓度增加，其含量逐渐降低，硼素缺乏和毒害胁迫处理均会导致IAA含量的降低，因此需选择适宜的硼浓度，而IAA能使入侵微生物易定殖于植物组织[32, 53]，增加根瘤菌的侵染位置。

本试验发现硼对两种不同来源的荧光标记根瘤菌生长影响不同，其中1 mg/L硼对12531f生长稍有促进作用，而100 mg/L硼对gn5f生长初期效果较好，随着时间的延长则无明显作用，表明菌株不同，对硼的敏感性也不同。但100 mg/L硼较利于12531f在根部定殖，而0.5 mg/L硼较利于gn5f在根部定殖，且接种60 d时根内仍可以检测大量荧光标记根瘤菌；而在苜蓿幼苗地上各组织内，1 mg/L硼可促进大量12531f运移并定殖于下部茎和下部叶内，60 d时下部茎内12531f定殖数量最多，100 mg/L硼则利用gn5f大量运移并定殖于下部茎内，45 d以后数量逐渐降低，60 d则未检测到。该结果可能由于添加适宜的硼后促进了根瘤菌EPS及LPS的形成，减弱了宿主苜蓿对两种荧光标记根瘤菌所产生的防御反应，或因为EPS及LPS对不同菌种活力及持久力的影响不同。

在苜蓿幼苗根系内，内源荧光标记根瘤菌gn5f的定殖数量高于外源荧光标记根瘤菌12531f，地上各部位，外源荧光标记根瘤菌12531f在1 mg/L硼作用下就可以大量定殖于下部茎和下部叶内，而内源荧光标记根瘤菌gn5f需在100 mg/L硼作用下才能达到较好效果。产生的原因一方面是与所选菌种类型有关，12531f的原始菌株12531为慢生型根瘤菌，代谢速率慢，而gn5f的原始菌株gn5为快生型根瘤菌，代谢速率快，二者遗传性状差异较大，因此生长过程中适宜的硼浓度不同(标记菌株与原始菌株特性未发生改变[34])。除与菌株本身遗传特性有关外，还可能因为适宜浓度的硼与12531f混合接种后竞争了宿主防御系统的应激位点或活性中心，使寄主防御性反应减弱，从而使得运移并定殖于植物体的外源荧光标记根瘤菌数量增加。

3.2 硼和荧光标记根瘤菌接种对苜蓿幼苗的影响

苜蓿种子内含根瘤菌[54]，陈丹明等[25]也发现未接种根瘤菌的4种苜蓿均出现结瘤现象，因此本试验中对照出现结瘤现象，但数量少于接种两种荧光标记根瘤菌的处理，说明种子内的根瘤菌竞争结瘤能力远不如所接种的根瘤菌[55]。硼在根瘤菌固氮、提高固氮酶活性方面有重要作用。硼通过影响根对根瘤菌的碳水化合物供应，而影响豆科植物根瘤的形成[56]。添加硼后可增加结瘤个数和根瘤重，王克武等[26]也发现平谷种植苜蓿配施硼后其单株结瘤数比对照提高14.56%，本试验中以12531f+1 mg/L硼和gn5f+100 mg/L硼处理结瘤效果较好。根瘤数量多，增加了根瘤干重和固氮能力。固氮能力的提高，进而可促进植株的生长。本试验发现接种根瘤菌并添加硼对苜蓿生物量、叶片数、株高和根长均有显著的促进作用。其中，1 mg/L硼和12531f接种后显著提高了苜蓿幼苗生物量、叶片数、株高、根长和生物量；100 mg/L和gn5f接种后显著提高了苜蓿幼苗生物量、叶片数、株高、根长和生物量。这是因为硼可改善根部氧气含量，促进根系生长[57]，利于糖分的积累，促进果实生长[58]，从而为形成较高的生物量奠定基础。何水华等[59]也发现叶面喷施速乐硼最佳浓度为0.08%，既能促进作物生殖生长，又可以明显改善其营养生长性状，有利于构建丰产的植株形态，提高产量。

紫花苜蓿叶片光合特性、生理代谢和光合产物代谢的变化可共同影响植株生长发育[60-61]。叶片数量的增加可以提高叶绿素含量及含氮量，利于植株进行光合作用[62]。硼利于叶绿体基质发育保护叶绿体被膜结构化，缺硼时植株叶片叶绿体基质发育退化，基粒数量减少从而影响植株光合速率[63]；杨建民等[64]在研究苹果树品种时发现叶含量与光合速率有正相关关系。本研究同样发现1 mg/L硼与12531f混合接种、100 mg/L硼与gn5f混合接种叶绿素含量分别显著高于对照和其他接种处理。说明接种根瘤菌同时添加硼可以促进紫花苜蓿叶片叶绿素的合成，其含量的增加可促进光合作用的进行，进而提高产量。

可见，适宜浓度的硼对根瘤菌的生长、在植物体内运移和定殖、结瘤和生长均有一定的促进作用，但须正确选取菌株的种类、考虑根瘤菌竞争结瘤能力、共生固氮有效性。本研究初步探索了硼对两种根瘤菌生长的影响，且只探索了硼对根瘤菌在苜蓿幼苗各组织内的运移和定殖，因此，后续研究会继续探索硼对根瘤菌在田间营养和生殖生长阶段苜蓿体内的运移和定殖。此外，还会继续寻找利于根瘤菌生长的其他外源物质和大量选取目标根瘤菌，为促进根瘤菌的运移和定殖效果并实现目的根瘤菌导入良种苜蓿种子提供理论依据。

4 结论

1)1 mg/L硼与12531f混合接种，100 mg/L硼与gn5f混合接种利于二者在苜蓿幼苗体内运移并定殖。

2)上述两种菌株与相应浓度硼混合接种苜蓿幼苗，对单株结瘤数、单株根瘤重、单株叶片数、株高、根长、地上鲜重、地上干重、根鲜重、根干重和叶绿素含量均有显著促进作用。

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Effect of boron on migration and colonization by rhizobia and seedling growth inMedicagosativa

MIAO Yang-Yang, ZHOU Tong, SHI Shang-Li*, KANG Wen-Juan, ZHANG Yun-Ting

CollegeofGrasslandScience,GansuAgriculturalUniversity,KeyLaboratoryforGrasslandEcosystemofMinistryofEducation,PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince,Sino-U.S.CentersforGrazingLandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China

The effect of boron on the migration and colonization of rhizobia in Gannong No.5 alfalfa (MedicagosativaGannong No.5) tissues and subsequently seedling growth were investigated by root drenching using two cyan fluorescent protein (CFP) tagged rhizobia;Ensifermeliloti12531f (12531f) andEnsifermelilotiGN5f (gn5f) containing different boron concentrations. The results showed that the best supplementation levels were less than 1 and 100 mg/L boron for 12531f and gn5f respectively. The optimum boron level enhanced the colonization of both rhizobia in alfalfa roots; colonization densities of 2184.99 and 58307.11 cfu/g were achieved by using 100 mg/L boron co-inoculated 12531f and 0.5 mg/L boron co-inoculated gn5f, respectively. Rhizobia were able to migrate to the aerial tissues and colonize lower stems and leaves through application of 1 mg/L boron co-inoculated 12531f and 100 mg/L boron co-inoculated gn5f, respectively. No fluorescent tagged rhizobia were detected in the control treatment. Individual plant root nodule number, nodule weight, leaf number, plant height, root length, aerial fresh weight, aerial dry weight, root fresh weight and root dry weight were increased by 21.31%-909.28% for the 1 mg/L boron co-inoculated 12531f treatment compared with control and zero boron innoculation. These traits were increased by 15.07%-1424.24% for the 100 mg/L boron co-inoculated gn5f treatment compared with control and zero boron inoculation treatments. Leaf chlorophyll content was reduced by 12531f without boron whereas 1 mg/L boron co-inoculated 12531f significantly increased the leaf chlorophyll content by 18.31% and 36.86% compared with the control and zero boron inoculation, respectively (P<0.05). Boron supplemented gn5f enhanced the leaf chlorophyll content; 100 mg/L boron co-inoculated gn5f increased leaf chlorophyll content by 24.41% and 12.92% compared with control and zero born inoculation, respectively (P<0.05). The results suggest that 1 mg/L boron co-inoculation with 12531f, 100 mg/L boron co-inoculation with gn5f promoted the migration and colonization of rhizobia in alfalfa seedlings, enhancing growth, indicating possible benefits for alfalfa cultivation.

fluorescent tagged rhizobia; boron;Medicagosativa; migration and colonization; growth promoting

10.11686/cyxb2016340

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-09-06；改回日期：2016-11-28

国家自然科学基金项目(31560666)资助。

苗阳阳(1989-)，女，满族，辽宁本溪人，在读博士。E-mail:yangyangmiao.com@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail:shishl@gsau.edu.cn

苗阳阳, 周彤, 师尚礼, 康文娟, 张运婷. 硼对根瘤菌在紫花苜蓿体内运移和定殖及对幼苗生长的影响. 草业学报, 2017, 26(4): 120-133.

MIAO Yang-Yang, ZHOU Tong, SHI Shang-Li, KANG Wen-Juan, ZHANG Yun-Ting. Effect of boron on migration and colonization by rhizobia and seedling growth inMedicagosativa. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(4): 120-133.