瓜蒌皮注射液中化学成分的UPLC/ESI-QTOF-MS分析

王辉俊+柯樱+叶冠

摘 要 目的：UPLC/ESI-QTOF-MS法鉴定瓜蒌皮注射液中的化学成分。方法：Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm× 100 mm， 1.8 μm），以水（A） 和乙腈 （B） 为流动相进行梯度洗脱。采用电喷雾离子源（ESI），正、负两种模式结合MSE技术测定。所得分子量及碎片信息与文献或已知数据库比对，鉴定化合物的结构。结果：在正负离子模式下，共鉴别出瓜蒌皮注射液化学成分19个，包括7个氨基酸、4个核苷酸、5个黄酮、1个多肽、1个唾液酸和1个含氮化合物。结论：建立了一种基于UPLC/ESI-QTOF-MS的对瓜蒌皮注射液化学成分快速鉴别的分析方法，为阐明瓜蒌皮注射液的化学物质基础提供依据。

关键词 瓜蒌皮注射液 UPLC/ESI-QTOF-MS 化学物质基础

中图分类号：R286 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）05-0060-06

UPLC/ESI-QTOF-MS Analysis of Chemical Constituents in Gualoupi Injection*

WANG Huijun**， KE Ying， YE Guan***

（Shanghai Pharmaceuticals Holding Co. Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To identify chemical compositions in Gualoupi injection. Methods： A method based on UPLC/ ESI-QTOF-MS combined with an automated MSE technique was successfully established and UPLC/ESI-QTOF-MS was performed with a column of Waters Acquity UPLC HSS T3 （2.1 mm × 100 mm， 1.8 μm） and a mobile phase consisted of water（phase A） and acetonitrile （phase B） by gradient elution. The detected peaks were identified by their elemental compositions or comparing MSE data with the literatures or public online databases. Results： A total of 19 compounds including 7 amino acids， 4 nucleic acids， 5 flavonoids， 1 peptide， 1 sialic acid and 1 nitrogen-containing compound were identified from Gualoupi injection at positive and negative ion models. Conclusion： A rapid and efficient method for studying the chemical constituents of Gualoupi injection by UPLC/ESI-QTOF-MS was established， which can lay the foundation for the substance basis study of Gualoupi injection.

KEY WORDS Gualoupi injection； UPLC/ESI-QTOF-MS； chemical substance basis

瓜蔞皮（Trichosanthis pericarpium）为葫芦科栝楼属植物栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxim）或双边栝楼（Trichosanthes rosthorinii Harms）的干燥成熟果皮[1]。瓜蒌皮注射液为上药集团旗下上海第一生化药业有限公司独家产品，是以瓜蒌皮为原料，经水提醇沉，再经过离子交换树脂洗脱而制成的灭菌水溶液，临床上用于冠心病、稳定型心绞痛的治疗[2-6]，具有行气除满，开胸除痹之功效。瓜蒌皮注射液临床应用广泛，但物质基础尚不明确，目前仅测定与功能主治无关的精氨酸作为含量检测标准[7]，现有的研究也仅仅停留在研究瓜蒌皮总提取物的药理活性上。鉴于瓜蒌皮注射液的活性成分及作用机制研究还属空白，本文将UPLC/ESI-QTOF-MS法与MSE技术结合，通过精确分子量、碎片离子、色谱行为和文献数据库信息鉴定了瓜蒌皮注射液中的一些化学成分，为阐明瓜蒌皮注射液的化学物质基础提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

瓜蒌皮注射液（上海医药集团股份有限公司上海第一生化药业有限公司提供，4 ml/支，批号1410408），水为超纯水（实验室自制）；HPLC级乙腈购自德国 Merck公司；其他的试剂均为分析纯。

1.2 仪器

Waters Acquity Ultra-Performance LC-Synapt G2 quadrupole time-of-flight （Q/TOF） 液质联用仪（美国Waters公司），配备ESI离子源以及Q-TOF四级杆-飞行时间质谱检测器，通过MassLynx 4.1数据分析软件对仪器进行控制和信息采集；SECURA225D型电子天平（德国赛多利斯）；Reference系列超纯水制备仪（美国密理博）；KQ-5200V型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.3 UPLC/ESI-QTOF-MS分析

1.3.1 供试品溶液的制备

取瓜蒌皮注射液20 μl加入980 μl超纯水涡旋混匀，并用0.22 μm微孔滤膜滤过备用，作为供试品溶液。

1.3.2 仪器分析条件

1）色谱条件 色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm ×100 mm，1.8 μm），配有预柱Waters Acquity HSS T3 VanGuard（2.1 mm × 5 mm，1.8 μm）；柱温：45 ℃；流速：0.3 ml/min；进样量：5 μl；以水（A） 和乙腈 （B） 为流动相进行梯度洗脱（表1）。

2）质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI），正、负离子两种模式测定，各参数分别为：毛细管电压-2.5 kV（ESI-）， +3 kV （ESI+）；锥孔电压-25 V（ESI-） ，+30 V（ESI+）；离子源温度120 ℃；脱溶剂气温度350 ℃；锥孔气流量50 L/h；脱溶剂气（N2）流速600 L/h；氩气作为碰撞气体；质量数检测范围50～1500 Da，低碰撞能量通道：4 eV；高碰撞能量通道：10～30 eV能量梯度。检测过程中通过lock spray将2 ng/ml的亮氨酸-脑啡肽溶液喷射进入离子源以校正仪器精确分子量（流速5 μl/min），负离子模式下其精确分子量为m/z 554.261 5 [M-H]-，正离子模式下的精确分子量为m/z 556.277 1 [M+H]+。

1.3.3 在线公共数据库

化合物查阅所用的在线公共数据库如下：ChemSpider[8]；SciFinder Scholar[9]；Riken[10]；PubChem[11]；Metlin[12]；Kegg Ligand Database[13]。

2 结果

通过准确分子量结合采用Waters Masslynx数据库Elemental composition 软件（含各元素精确质量数）判定潜在代谢产物的分子式；结合MSE技术产生的离子碎片与文献报道的该药材中化合物进行比对，或代入天然产物数据库进行搜索[14]；通过以上方法在瓜蒌皮注射液中共鉴定了19个化学成分（表2），主要包括氨基酸类、核苷类、黄酮类、多肽类和唾液酸等。

2.1 氨基酸类

在瓜蒌皮注射液中鉴定了7个氨基酸，精氨酸（1）、苏氨酸（2）、瓜氨酸（3）、脯氨酸（4）、酪氨酸（7）、苯丙氨酸（10）和色氨酸（14）（图2）。氨基酸主要是丢失CO2和NH3。如3号峰一级质谱中[M-H]- 为174.087 7，为瓜氨酸，在二级质谱信息中，m/z 131.081 8为失去一个酰胺基。7号峰一级质谱中[M-H]- 为180.065 4，为酪氨酸，在二级质谱信息中，m/z 163.039 2为失去一个氨基。10号峰一级质谱中[M-H]- 为164.067 5，为苯丙氨酸，在二级质谱信息中，m/z 147.041 0为失去一个氨基，m/z 103.051 9为失去一个氨基和羧基（图3A）。通过与数据库比对均一致。

2.2 核苷类

在瓜蒌皮注射液中鉴定了4个核苷酸类成分：黄嘌呤（6）、鸟苷（8）、腺嘌呤（9）和腺苷（12）（图2）。9号峰一级质谱中[M+H]+ 为136.061 9，为腺嘌呤，在二级质谱信息中，m/z 119.034 6为失去一个氨基。12号峰一级质谱中[M+H]+ 为268.104 2，为腺苷，在二级质谱信息中，m/z 136.061 3为失去一个核糖基团（图3B）。

2.3 黄酮类

黄酮类化合物是一类具有2-苯基色原酮结构的化合物。在自然界主要存在于水果、蔬菜、坚果、种子、花和果皮中[15]。在植物的生长发育过程以及抗菌防病等方面起着重要的作用。本研究中共鉴定了5个黄酮类化合物，分别为木犀草素（13）、芦丁（16）、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷（17）、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷（18）和香叶木素-7-O-β-葡萄糖苷（19）（图2），大多数是以糖苷的形式存在，且都是氧苷类化合物。此类化合物糖苷键易断裂[16-17]。如18号峰一级质谱中[M+H]+为433.112 3，为芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷，二级碎片离子有m/z 271.059 2（奇电子离子）和m/z 272.062 9（偶电子离子），推测为丢失1分子葡萄糖后的基团；19号峰一级质谱中[M+H]+为463.123 9，为香叶木素-7-o-β-葡萄糖苷，二级碎片离子有m/z 301.071 0（奇电子离子）和m/z 302.073 2（偶电子离子），推测为丢失1分子葡萄糖后的基团（图3C）。

2.4 多肽类

在瓜蒌皮注射液中鉴定了1个多肽类化合物S-乳酰谷胱甘肽（15）（图2）。多肽质谱规律主要为酰胺键的断裂和氨基酸氨基和羧基的丟失为主。15号峰一级质谱中[M-H]- 为378.097 1，为S-乳酰谷胱甘肽，在二级质谱信息中，化合物硫健断裂失去硫代基团得到m/z 306.076 4，再失去两分子羧基得到碎片离子m/z 215.079 5。

2.5 其它

在瓜蒌皮注射液中鉴定了1个唾液酸N-乙酰神经氨酸（11）和1个含氮化合物V-PYRRO/NO（5）（图2）。11号峰一级质谱中[M+H]+为310.112 3，为N-乙酰神经氨酸，在二级质谱信息中，m/z 292.117 2为母离子失去一分子水得到的碎片。5号峰一级质谱中[M-H]-为158.092 1，为V-PYRRO/NO，在二级质谱信息中，m/z 112.086 5与数据库中碎片相吻合。

3 討论

被鉴定出的化合物主要包括氨基酸类、核苷类、黄酮类、多肽类和唾液酸等，其中氨基酸和核苷类出峰时间主要集中在0～3 min，黄酮类则主要在7～10 min之间。这主要是由于氨基酸类成分极性较强，色谱柱上保留时间短，出峰早；而黄酮类成分极性相对较小，在C18色谱柱上保留时间较长，出峰也较晚。在没有对照品的情况下，我们结合MSE技术（MSE技术是由高、低碰撞能两种扫描交替构成，能够在一次液质分析中同时获得高精确的母离子及碎片离子信息的串联质谱方法），同时记录母离子和碎片离子信息，并通过母离子与碎片离子具有相同色谱行为的特性进行母离子和子离子的关联归属，同时结合文献和数据库对化合物进行结构解析，能够全面、精确、简单、灵活地鉴定出天然产物中化合物的结构[18-19]。本研究共鉴定出19个化合物，其中色氨酸（14）、鸟嘌呤核苷（8）、多肽S-乳酰谷胱甘肽（15）、唾液酸N-乙酰神经氨酸（11）和含氮化合物V-PYRRO/ NO（5）为首次发现，这为阐明该注射液的化学物质基础提供了依据。

参考文献

[1] 国家药典委员会： 中华人民共和国药典2015年版一部[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2015： 114.

[2] 莫子明， 张志广， 廖尚宇. 瓜蒌皮注射液治疗冠心病稳定型心绞痛的临床观察[J]. 国外医学（内科学分册）， 2005（8）：357-359.

[3] 桑俊， 雍秀华. 瓜蒌皮注射液辅助治疗冠心病稳定型心绞痛的临床观察[J]. 中国卫生产业， 2013（7）： 63.

[4] 刘莉， 牛新萍. 瓜蒌皮注射液对稳定型心绞痛痰瘀互结证血管内皮功能的影响[J]. 中西医结合心脑血管病杂志， 2014， 12（1）： 3-5.

[5] 宋宏雁， 班努·库肯. 瓜蒌皮注射液治疗不稳定型心绞痛疗效观察[J]. 现代中西医结合杂志， 2009， 18（31）： 3820-3821.

[6] 赵然尊， 石蓓， 王冬梅， 等. 瓜蒌皮注射液治疗冠心病稳定型心绞痛合并2型糖尿病的临床观察[J]. 中国新药杂志， 2010， 19（20）： 1871-1874.

[7] 陆琛， 黄臻辉. 瓜蒌皮或瓜蒌皮注射液的液相色谱指纹图谱测试方法： 中国， CN200610118771.6[P]. 2007-10-24.

[8] ChemSpider. Search and share chemistry， Royal Society of Chemistry [EB/OL]. [2016-12-01]. http：//www.chemspider. com.

[9] SciFinder Scholar. American Chemical Society [EB/OL].[2016-12-01]. https：//scifinder.cas.org.

[10] Riken. RIKEN Center for Sustainable Resource Science： Metabolomics Research Group， LC-MS Branch [EB/OL].[2016-12-01]. http：//spectra.psc.riken.jp/menta.cgi/index.

[11] PubChem. National Center for Biotechnology Information[EB/OL]. [2016-12-01]. http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov.

[12] Metlin， the Scripps Research Institute [EB/OL]. [2016-12-01]. http：//metlin.scripps.edu.

[13] Kegg Ligand Database. Kyoto University [EB/OL]. [2016-12-01]. http：//www.genome.jp/kegg/ligand.html.

[14] Wang D， Qi M， Yang Q， et al. Comprehensive metabolite profiling of Plantaginis Semen using ultra high performance liquid chromatography with electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry coupled with elevated energy technique [J]. J Sep Sci， 2016， 39（10）： 1842-1852.

[15] Cook N， Samman S. Flavonoids—chemistry， metabolism， cardioprotective effects， and dietary sources[J]. J Nutr Biochem， 1996， 7（2）： 66-76.

[16] 徐英， 董静， 王弘， 等. 电喷雾-离子阱-飞行时间质谱联用研究黄酮和异黄酮苷元C环上的裂解规律[J]. 高等学校化学学报， 2009， 30（1）： 46-50.

[17] 黄辉强， 冯毅凡， 芮雯， 等. 紫花杜鹃中黄酮类成分的UPLC/Q-TOF-MS分析[J]. 中国中药杂志， 2009， 34（7）： 875-878.

[18] Plumb RS， Johnson KA， Rainville P， et al. UPLC/MSE： a new approach for generating molecular fragment information for biomarker structure elucidation[J]. Rapid Commun Mass Spectrom， 2006， 20（13）： 1989-1994.

[19] Han H， Xiong AZ， He CY， et al. Combination of UHPLC/ Q-TOF-MS， NMR spectroscopy， and ECD calculation for screening and identification of reactive metabolites of gentiopicroside in humans[J]. Anal Bioanal Chem， 2014， 406（6）： 1781-1793.