籼粳交水稻花药培养条件的优化

张选明,魏芳勤,张 星,沙志鸿,赵胜利,张秀英,王艳龙

(汉中市农业科学研究所,陕西汉中 723000)

籼粳交水稻花药培养条件的优化

张选明,魏芳勤,张 星,沙志鸿,赵胜利,张秀英,王艳龙

(汉中市农业科学研究所,陕西汉中 723000)

旨在筛选最适出愈培养基，以水稻籼粳交品种的花药为植体，以预处理时间、2,4-D质量浓度、播期、接种密度、叶枕间距为因素的正交试验，通过方差分析研究影响籼粳交后代花药出愈率的主要因素，并对其最适值进行优化。成苗阶段研究MS培养基中加入4种不同植物激素、在不同的愈伤培养时间以及培养温度处理条件下对籼粳交材料愈伤组织成苗率的影响。结果表明，不同籼粳交材料后代均在3号M8培养基的出愈率最高；预处理时间、叶枕间距的差异达到极显著水平。在分化成苗阶段，蔗糖是影响成苗阶段的主要因素，其次为6-BA，且分别在30 g/L、4 mg/L时分化率最高。愈伤培养30 d转接分化率最高；培养温度为29 ℃时绿苗率最高。表明，M8+8 mg/L 2,4-D+8 mg/L NAA+4 mg/L KT+2 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂为最优出愈培养基；预处理时间和叶枕间距是影响出愈率的主效因子，最适宜分化培养基配比为MS+6-BA 4 mg/L +蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L；最佳愈伤转接时间为30 d；最佳培养温度为29 ℃。

水稻；籼粳交；花药；愈伤组织；再生体系

籼粳亚种间的杂交水稻利用籼粳间远缘杂种优势，具有高产优质的特点，是中国重要的杂交高产水稻类型之一。籼粳交水稻的单位面积产量在全国水稻主产区一直居于前列，在粮食生产中占有重要地位[1-2]。水稻籼粳交或远源杂交，是创制和改良水稻种质资源的重要手段，但杂交后代疯狂分离，子代自交系稳定需要8～10代以上，选育周期长，难以利用。而利用花药培养获得单倍体愈伤组织分化成苗获得的植株不存在显隐性问题，加倍后即可获得纯合植株，缩短育种年限，加快育种进程，是一项较为实用的生物育种辅助技术[3-6]，也是建立DH群体的重要方法[7]。但育种目标的实现要求以高频出愈率和绿苗再生率为基础，才能保证足量的基础群体，而在实际操作中，有很多因素影响培养效果。虽然水稻花药培养研究相关报道较多[8-15]，但对陕南籼粳交花药培养特性较系统的研究鲜见报道。本研究通过对籼粳交水稻花药离体培养过程中不同培养基、激素、温度等的研究，旨在建立稳定、高效的籼粳交水稻花药培养再生体系，为陕西省籼粳交水稻育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试籼梗交水稻品种包括‘[(轮回422/lement)F5/华恢25]’F1(V1)、‘(台粳56/华恢60)’ F1(V2)和‘(沈农256/中413)’F1(V3)，均由汉中市农业科学研究所水稻研究中心提供。

1.2 方 法

1.2.1 花药培养 采用2步成苗法，取花粉母细胞中处于单核靠边期的幼穗，8～10 ℃冷柜中预处理10 d后，在超净工作台经φ=0.1%升汞溶液浸泡10 min，无菌水漂洗4～5次，用剪颖抖药法接种至诱导培养基[16]，于25 ℃暗培养条件下诱导愈伤组织，诱导出的愈伤组织立即转入分化培养基，于(29±3)℃光照条件下培养，3 000 lx光照度下诱导分化。

1.2.2 出愈伤阶段培养基优化 以‘[(轮回422/lement)F5/华恢25]’F1、‘(台粳56/华恢60)’F1和‘(沈农256/中413)’F13个籼粳交材料F1代水稻花药为植体，接种花药数分别为840、280、400。诱导籼粳交花药愈伤组织基本培养基设3个配方、对应编号为1号、2号、3号(表1)，培养40 d后统计愈伤组织数，计算不同培养基的出愈率，以此筛选优化培养基。

1.2.3 出愈伤阶段培养条件相关因素优化 以‘(沈农256/中413)’F1花药为植体，设计适用4 水平1因素+ 2 水平4 因素的8 处理正交试验(表2)。考察低温预处理时间、浸润稻穗茎节不同2,4-D质量浓度(ρ)、播期、接种密度、剑叶与倒二叶叶枕间距5 因素对水稻花药培养出愈率的影响，试验用剪颖抖药法接种，30 d 后每隔5 d 统计出愈率。试验数据用DPS软件处理，筛选主效影响因子，得到最佳组合。

1.2.4 愈伤分化成苗阶段的分化培养基优化 以‘(沈农256/中413)’F1愈伤组织为植体，设计4因素3水平的正交试验[17-20](表3)，考察转接于加入蔗糖和6-BA等4种植物激素的MS培养基上分化成苗的数目(培养30 d)，计算成绿苗率。试验数据用DPS软件进行方差分析。

表1 不同愈伤培养基配方Table 1 Recipes of different culture mediums

表2 L841+24正交试验Table 2 Orthogonal table of L841+24

表3 L934正交试验Table 3 Orthogonal table of L934

1.2.5 不同培养时间对愈伤组织分化成苗的影响 以籼粳交后代材料‘(沈农256/中413)’F1及‘[(轮回422/lement)F5/华恢25]’F1愈伤组织为植体的花药愈伤组织为植体，分别于愈伤培养26、30、35、40、45 d接种于优化后的分化培养基，统计绿苗率。

1.2.6 愈伤分化成苗阶段的培养温度优化 以籼粳交后代材料‘(沈农256/中413)’F1愈伤组织为植体，转接于优化后的分化培养基，愈伤组织形成30 d时分别于26、29、31 ℃ 3个培养温度下培养30 d，统计分化的绿苗数和总苗数，计算不同培养温度下的绿苗率。

1.2.7 统计方法 出愈率=形成愈伤组织块数/ 接种花药数×100%

分化率=(分化绿苗数+分化白苗数)/ 转移愈伤组织块数×100%

绿苗率=分化绿苗数/ (分化绿苗数+分化白苗数)×100%

2 结果与分析

2.1 出愈伤阶段培养基优化

‘[(轮回422/lement)F5/华恢25]’F1在3号培养基上的出愈率最高为15.0%，2号培养基出愈率最低为9.0%。‘(台粳56/华恢60)’F1在3号培养基上的出愈率最高为12.9%，2号培养基出愈率最低为5.4%。‘(沈农256/中413)’F1在3号培养基上的出愈率最高为21.0%，2号培养基出愈率最低为11.0%(表4)。3种不同籼粳交材料后代均以3号培养基出愈率最高，为最适宜用于陕南籼粳交材料的培养基。

表4 3个籼粳交材料接种不同培养基的出愈率Table 4 Callus rate of three indica/japonica hybrid materials in different mediums

2.2 出愈伤阶段培养条件相关因素优化

以接种第40天的出愈率为数据(表5)，各个因素对出愈率的影响进行DPS 正交试验方差分析。由表6和表7可以看出，5个因素均能影响水稻花药培养愈伤组织的产生。预处理时间、叶枕间距的差异均达到极显著水平(P<0.01)，播期、密度、2,4-D 质量浓度均未达到显著水平(P>0.05)。说明预处理时间和叶枕间距是本试验中影响出愈率的主效因子，而播期、密度、2,4-D质量浓度为非主效因子。从表7可以看出，预处理时间的极大值为K4，即预处理10 d为最佳水平，叶枕间距的极大值为K1，即叶枕间距5～8 cm为最优水平，2,4-D质量浓度、播期和接种密度的最优水平分别为K2、K1和K2，即最优组合为：4 mg/L， 60 枚/瓶，4月10日。

表5 影响出愈率的正交试验Table 5 Orthogonal test affecting callus rate

2.3 成苗阶段分化培养基优化

以接种培养第30天的分化率为数据(表8)，将各因素对分化率的影响进行DPS 正交试验方差分析(表9，表10)。以KT为空闲列的方差分析结果可知：蔗糖质量浓度的差异达到极显著水平(P<0.01)，6-BA、NAA的差异未达到显著水平(P>0.05)，说明蔗糖质量浓度在本试验中是影响分化率的主效因子，而其他3个因素是次要影响因子。

表6 正交试验的方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal test

表7 影响出愈率的各因素极差值Table 7 Range of different factors affecting callus rate

表8 正交试验愈伤分化率Table 8 Differentiation rate of callus in orthogonal test

表9 水稻花药愈伤分化率的方差分析Table 9 Variance analysis of callus differentiation rate in rice anther

从表10可知，蔗糖质量浓度R值最大为162.350 0，其次为6-BA(45.150 0)，因此，第1影响因子为蔗糖质量浓度，第2影响因子为6-BA质量浓度。从各因素的极大值可知，蔗糖质量浓度极大值为K1，即 30 g/L，6-BA质量浓度极大值为K3，即4 mg/L。NAA、KT的影响极小，极大值都为K2即0.5 mg/L。因此， MS+6-BA (4 mg/L)+蔗糖(30 g/L) +琼脂(6 g/L)可作为籼粳交材料愈伤组织的最适宜分化培养基。

2.4 不同培养时间对愈伤组织分化成苗的影响

不同培养时间分化绿苗率统计数据见表11，2个籼粳交材料分化成绿苗率随愈伤培养时间的变化趋势见图1。不同品种的籼粳交愈伤组织材料在相同培养条件下绿苗分化率范围有显著差异，其中‘(沈农256/中413)’F1不同培养时间转接愈伤成苗分化率为93.8%～134.4%，‘[(轮回422/lement)F5/华恢25]’F1的分化率为57.6%～97.2%。但由图1可知，2个籼粳交材料分化率随愈伤培养时间的变化趋势一致。从愈伤培养26 d开始，随着培养时间的延长，转接分化率有上升的趋势，于第30天达到峰值，随着愈伤培养时间的延长，转接后分化率逐渐降低，在第45天降至最低。

由以上结果可知：愈伤组织在第30天时进行接种分化易分化成苗，可认为愈伤组织培养30 d为水稻籼粳交后代花药培养愈伤组织转接分化成苗的最佳时间。

表11 愈伤组织不同培养时间的分化率Table 11 Differentiation rate of callus in different culture time

图1 培养26～45 d愈伤组织的分化率Fig.1 Differentiation rate of callus culture in 26-45 days

2.5 愈伤分化成苗阶段培养温度优化

由表12可知，随着分化温度的提高，分化率相应由45.67%提高至66.31%，而绿苗率则在培养温度为29 ℃时达到最高(44.22%)，为3个温度中的最大值。由以上结果可知：培养温度为29 ℃ 时，花药愈伤的分化绿苗率最高。

3 结论与讨论

郭书巧等[21]研究表明，籼粳杂交F1代激素配比为2,4-D 2 mg/L、NAA 1 mg/L、KT 0.2 mg/L时培养效果最好。李大林[22]认为2,4-D 4 mg/L 浸稻穗茎节，能提高花药成苗率，但本研究结果表明2,4-D 处理对出愈率影响不大，可能2,4-D对水稻花药培养力的影响在成苗期而非出愈期，也可能其最佳培养质量浓度因基因型不同而不同。

表12 不同培养温度下的成苗情况Table 12 Seedling status under different culture temperatures

水稻花药培养一般要求稻穗在8～10 ℃低温预处理8～10 d，本研究结果表明处理10 d效果最佳。花药培养接种最佳叶枕间距为5～8 cm，但颖壳经消毒冲洗后完全变软，剪壳后花药粘贴在花药壁，很难抖落，接种速度慢。因此小叶枕间距不利于试验操作，但出愈率高。该结果确定取样标准，对接种技术提出更高要求。同样，花药接种第30～35天的愈伤组织转分化的成苗率显著优于培养40 d后的愈伤组织，但由于此时期的愈伤组织还太小，有些还粘在花药壁上，转接分化培养基时操作较为困难。因此，应综合考虑各培养因素，从而达到提高水稻花药培养水平的目的。

籼粳交水稻花药培养在分化成苗阶段存在绿苗分化率偏低的现象。孙宗修等[23]发现：籼粳交水稻花药培养的绿苗率为0.52%～3.16%。在花药培养过程中影响绿苗分化的因素较多，关世武[24]研究发现：转接愈伤的状态和时期对愈伤分化为绿苗的影响较大。本研究通过愈伤转接时期试验和不同培养温度试验,确定陕西籼粳交水稻花药培养愈伤转接时间为30 d、培养温度为29 ℃时，可达到较高的绿苗分化率。

通过本试验研究，基本了解陕西籼粳交花药离体培养的培养效果，初步建立稳定的离体再生体系，为加快陕西籼粳交材料的基因纯合、遗传分析、分子标记等研究奠定基础，其他影响因素的研究在此基础上有待进一步优化。

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(责任编辑：顾玉兰 Responsible editor:GU Yulan)

Optimization of Culture Conditions of Anther Culture in Indica/Japonica Hybrid Rice

ZHANG Xuanming,WEI Fangqin,ZHANG Xing,SHA Zhihong,ZHAO Shengli,ZHANG Xiuying and WANG Yanlong

(Hanzhong Agricultural Science Research Institute,Hanzhong Shaanxi 723000,China)

In order to improve culture efficiency of anther in indica/japonica hybrid rice,cultivars of the indica/japonica hybrid rice were used for screening culture medium,the orthogonal test of five factors was designed,which the five factors were the pretreatment days,the mass concentration of 2,4-D,the sowing date,and the inoculums density and the occipital lobe spacing. Furtherly,at the seedling stage,the test based on the MS culture medium with different plant hormones,different culture time and culture temperature conditions. Seedling rate of cross material callus in indica japonica were investigated in the paper. The results showed that the callus rate of three different indica/japonica hybrid materials were the highest in No.3 M8 medium. The pre-treatment days and the inoculums density reached at very significant level.At the seedling stage,sucrose content was the primary impact factor,followed by the concentration of 6-BA. And differentiation rate of 30 g/L,4 mg/L respectively was highest. The highest differentiation rate of callus culture time was 30 d. When the culture temperature was 29 ℃ it had the highest rate of plantlet differentiation. It was concluded that M8+8 mg/L 2,4-D+8 mg/L NAA+4 mg/L KT+2 mg/L 6-BA+30 g/L sucrose and 6 g/L agar was the optimum medium at the callus stage,while and MS+6-BA 4 mg/L+sugar 30 g/L and agar 6 g/L was the most appropriate media ratio for seedling differentiation at the seedling stage.In conclusion,the best callus transit time was 30 days and the optimum culture temperature was 29 ℃.

Rice；Indica-japonica cross；Anther；Callus；Regeneration system

ZHANG Xuanmin,male,senior agronomist.Research area:hybrid rice breeding.E-mail:1722580530@qq.com

ZHANG Xing,female,agronomist.Research area:hybrid rice breeding.E-mail:825970451@qq.com

日期：2017-03-30

2016-08-26

2016-11-02

陕西省科学技术研究发展计划农业攻关类(2014k02-03-01)。

张选明，男，高级农艺师，主要从事杂交水稻育种工作。E-mail:1722580530@qq.com

张 星，女，农艺师，主要从事杂交水稻育种工作。E-mail:825970451@qq.com

S188

A

1004-1389(2017)04-0544-08

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170330.1508.018.html

Received 2016-08-26 Returned 2016-11-02

Foundation item Shaanxi Science and Technology Research and Development Project in Agriculture(No. 2014k 02-03-01).