细菌耐药性产生的分子机制及对细菌毒力的影响研究进展

赵秋云，袁富威，刘瑞琪，王玮玮，徐永平，张为民*，卿素珠*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.河南牧翔动物药业有限公司，河南郑州 451162)

文献综述

细菌耐药性产生的分子机制及对细菌毒力的影响研究进展

赵秋云1，袁富威2，刘瑞琪1，王玮玮1，徐永平1，张为民1*，卿素珠1*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.河南牧翔动物药业有限公司，河南郑州 451162)

抗菌药物选择压力导致细菌耐药性日趋严重，一些细菌菌株的分子耐药机制会引起细菌致病性的改变，说明两者之间存在一定的相关性。论文从细菌胞壁、胞膜、胞质和染色体4个部分概述了其相关主要大分子物质参与细菌耐药的机制，介绍了与耐药性密切相关的生物大分子参与细菌致病的过程，分析细菌耐药性的产生对细菌毒力变化的影响，以期为解决现今较严重的细菌耐药性及细菌性疾病的防治难题找到新方法和突破点。

细菌；耐药性；分子机制；毒力

自1928年英国细菌学家弗莱明首先发现了青霉素之后，人类陆续发现和开发了许多抗生素，在很大程度上抑制了病原菌的传播。抗生素具有杀菌抑菌、促生长作用，近年来规模化养殖得益于抗生素的使用，发展十分迅速。然而，由于临床应用抗生素普遍缺乏科学合理的指导，导致了细菌对抗生素的耐药性越来越严重，已经引起全世界的普遍关注。病原菌的致病过程是与宿主细胞相互作用的复杂过程，需要许多毒力因子的协调作用。毒力因子是病原菌为适应环境其基因选择表达的产物。相关资料分析表明，细菌毒力与耐药是造成细菌性疾病难以防治的两个重要因素，在疾病感染中发挥关键作用。近年的研究表明，一些细菌菌株的耐药机制会引起细菌致病性的改变，虽然耐药性和细菌毒力不是同时出现的，但是两者之间存在共同点和相关性。本文从细胞结构角度阐述细菌胞壁、胞膜、胞质和染色体部位相关主要大分子物质参与细菌耐药的分子机理及与耐药性有关的细菌毒力，并分析细菌耐药性对细菌毒力的影响，以期为解决现今较严重的细菌耐药性及细菌性疾病的防治难题找到新方法和突破点。

1 细菌胞壁结构与成分及对毒力的影响

青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins，PBPs)是一组位于细胞内膜上具有催化作用的酶，参与细胞壁的合成、形态维持和糖肽结构的调整等。细菌PBPs与β内酰胺类抗生素结合，使胞壁黏肽的交联受到阻碍，引起胞壁缺损，造成菌体内较高的渗透压使得菌体裂解，而其在菌体内的异常表达，如数量减少、亲和力下降或诱导性PBPs的产生等是细菌对β内酰胺类抗生素产生耐药性的主要机制之一。

临床分离的金黄色葡萄球菌胞壁主要有细胞壁自溶素(autolyti，ALT)和纤维连接蛋白(formin binding protein，FnBP)或细胞间多糖黏附素(polysaccharide intercellular adhesion，PIA)和聚N-乙酰葡萄糖胺(poly N-acetyl glucosamine，PNAG)2种组合，由icaADBC基因簇编码合成。甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin sensitiveStaphylococcusaureus，MSSA)菌株生物膜的形成依赖于PIA/PNAG，而耐甲氧西林菌株生物膜类型则是与ATL / FnBP介导相关，这表明细菌对β内酰胺类抗生素的敏感性和生物膜类型之间有关系[1]。Rudkin J K等[2]证明甲氧西林耐药性菌株可以通过干扰agr群体感应系统减弱耐药菌株的毒力，通过这种方式，细菌分泌溶细胞毒素的能力系统减弱，导致毒素的表达减少。Hicks L A等[3]分析了肺炎链球菌中β内酰胺获得耐药性和毒力消失之间的关系，发现经过耐药基因转化了的敏感菌株毒力会明显减弱。这些研究表明，细菌对β内酰胺类抗菌素的耐药性大小与细菌毒力的强弱呈负相关。

2 细菌胞膜结构与成分及对毒力的影响

2.1 膜孔蛋白

膜孔蛋白(membrane protein，MPs)是存在于生物膜上的蛋白通道，营养素、毒素和抗生素可以通过它进行扩散。膜孔蛋白表达的改变或减少，可在一定程度上影响细菌产生耐药性[4]。铜绿假单胞菌外膜上存在微孔蛋白OprC、OprD和OprE，其中OprD2是亚胺培南扩散的特殊通道，铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要机制就是OprD2外膜孔蛋白的缺失[5]。鲍曼不动杆菌外膜上存在通道蛋白CarO，其对亚胺培南耐药的机制也是由于亚胺培南进入鲍曼不动杆菌菌体的孔道CarO蛋白的缺失或表达的降低[6]。

鲍曼不动杆菌MPs不仅和耐药性有关[7]，而且MPs可通过攻击线粒体诱导上皮细胞和树突状细胞的死亡[8]，是细菌的一种毒力因子，并且在生物膜的形成过程中起关键作用[9]。Fernandez-Cuenca F等[10]也通过试验证实，毒力的减弱和CarO和OprD样膜孔蛋白的表达有关，此膜孔蛋白的表达又与逐渐增加的鲍曼不动杆菌耐药性有关系。

2.2 外排泵

外排泵是细菌胞膜上的一类蛋白质，其产生耐药机制的原因是外排泵的过度表达而将抗菌药物及其代谢产物选择性或非选择性的排出菌体外[11]。目前抗菌药物耐药相关的外排泵可分为五大家族，即主要易化子超家族(major facilitation superfamily，MFS)、多药和毒性化合物外排(multidrug and toxic compound extrusion,MATE)家族、ATP结合盒(ATP binding cassette,ABC)超家族、耐药结节分化(resistance-nodulation-cell division,RND)家族和小多重耐药(small multidrug resistance,SMR)家族[属于药物/代谢物转运蛋白(drug/metabolite transporter,DMT)超家族][12]。而质子泵抑制剂为一种抑制质子转运的解耦联剂，能抑制主动外排耐药系统能量来源的质子浓度梯度，使转运蛋白失去能量供应，从而破坏外排系统的主动外排作用，表现为药物在细菌中的蓄积显著增加，恢复细菌对药物的敏感性[13]。研究表明，鲍氏不动杆菌不仅产碳青霉烯酶，还可通过降低细胞膜通透性，如外膜孔道蛋白缺失、改变青霉素结合蛋白和主动外排系统活性增强等导致细菌产生多药耐药[14]。

外排机制的消除不仅对抗生素的耐药性有影响而且影响着细菌毒力。耐药菌中超表达的外排泵可通过泵出与毒力因子表达相关的酶，最终导致胞外与群体感应调节有关的几种毒力因子的表达减少。另外，在细菌的致病过程中，胞内代谢物成为重要的致病因子，外排泵的作用下可将胞内代谢物泵出胞体外，因此外排泵是细菌重要的毒力因子。Posadas D M等[15]报道，布鲁氏菌BepC外排泵可排出菌体内的毒性物质，如溶血毒素、抗生素，在产生耐药性的同时，减弱细菌的致病性。通过线虫模型检测菌株的毒力，发现耐药菌毒力减弱，表明外排泵的改变影响了细菌对抗生素的耐药性和毒力[16]。

Beutlich J等[17]就外排泵参与抗生素的耐药性与毒力之间的联系进行了研究，发现沙门菌属基因tetG编码Tet外排泵，同时包含多药耐药性区域，关于抗生素选择压力的研究发现，虽然从未使用四环素，但是分离的菌株中12%是对四环素耐药，均携带tet(A)(49%)或者tet(B)(51%)基因，携带P菌毛和杆菌素等毒力基因的耐药菌菌株要多于敏感菌。

3 细菌胞质结构与成分及对毒力的影响

3.1 核糖体

核糖体是原核生物蛋白质合成的场所，由2个核糖核蛋白亚基50 S和30 S组成。干扰核糖体蛋白质的合成过程是许多抗生素抗菌的主要抑菌机理之一，原核生物通过对核糖体rRNA的修饰，可以影响核糖体的组装和活性，使细菌对抗生素产生耐药性[18]。研究表明，核糖体甲基化酶的作用下，16 S rRNA氨酰基部位甲基化作用阻碍了氨基糖苷类抗生素与氨酰基的结合，进而影响细菌对氨基糖苷类抗生素的敏感性[19]。

核糖体rRNA的甲基化是细菌对核糖体的修饰中比较保守的一种，对调节转录后RNA的功能和抗生素抗药性机制的产生非常重要[20]。而关于核糖体蛋白质的异常合成及对毒力影响的研究所见不多。通过对一系列同基因大肠埃希菌突变体的研究发现，16 S rRNA甲基化酶不能增加细菌的适应性，对细菌毒力影响不显著[21]。

3.2 获得耐药性

获得耐药性是耐药基因通过质粒等载体在种群之间进行传播而导致的，如转座和位点特异性重组机制。耐药基因可存在于细菌染色体或质粒中，质粒携带非细菌生命所必须的遗传物质，可编码性菌毛、细菌素、毒素和耐药性等。细菌的DNA可以通过3种方式发生转移，即转化、转导和接合转移，被转移基因片段往往含有大量可移动耐药基因元件。许多耐药性质粒都可以通过接合的方式进行转移，比如带有性菌毛的菌体质粒或染色体，可通过中空的性菌毛进入与其耦联的菌体内。研究发现，获得不同的耐药基因片段将使细菌获得不同机制的复杂的抗生素耐药性。喹诺酮类耐药基因的存在比较普遍，常见的如qnr基因。肺炎克雷伯菌质粒介导喹诺酮类耐药基因有qnr、aac(6′)-Ib-cr和qepA[22]。氨基糖苷类抗生素的耐药基因(编码AACs、APHs和ANTs)常位于不同的MGEs中，例如整合子和质粒[23]，常和其他耐药基因共存。四环素类药物耐药性的产生与其所携带的耐药基因密切相关，耐药基因通过质粒或转座子在细菌之间传播[24]，而耐药基因tetA、tetB、tetC、tetD和tetE，可编码能量依赖性膜转运蛋白，将细菌细胞体内的四环素类抗生素转运至体外，从而减少胞内四环素的浓度。

细菌获得耐药质粒对细菌的毒力也会产生影响。刘珍等[25]研究表明质粒pRST98能够促进鼠伤寒沙门菌和大肠埃希菌形成生物膜促进细菌对细胞的黏附，同时抑制细菌对细胞的侵袭力，增强细菌抵抗血清杀菌及巨噬细胞吞噬的能力。说明伤寒杆菌耐药质粒pRST98不但介导对药物的抗性，同时还能使宿主菌的毒力增强。

4 细菌染色体靶向修饰及对毒力的影响

基因的靶向修饰是在分子水平上对基因进行修饰的过程，如删除某一基因、去除外显子或导入点突变等，均可引起基因的功能改变。氟喹诺酮类药物作用位点是DNA促旋酶和拓扑异构酶，而细菌耐药性机制之一就是由gryA和gryB 2个染色体基因编码的DNA促旋酶、parC和parE染色体基因编码的拓扑异构酶的点突变[26-27]，从而影响药物与作用位点结合，致使细菌耐药性发生。而革兰阴性菌的作用靶位是促旋酶，革兰阳性菌的作用靶位是拓扑异构酶，因此染色体靶向修饰的改变均可能引起革兰阴性菌或革兰阳性菌对药物敏感性的变化。

此外，染色体突变导致的细菌耐药性可能会影响细菌的适应性。对喹诺酮耐药的菌株的适应性在种群之间是不同的，依赖于耐药突变的水平、数量、程度和野生菌株相比表现出显著较低的适应水平[28-29]。鲍曼不动杆菌对环丙沙星的耐药性是异构酶和DNA促旋酶的突变[30]，可导致耐药菌的适应性和毒力减弱。通过分析铜绿假单胞菌喹诺酮耐药决定区基因突变，发现Ⅲ型分泌系统基因gyrA和parC发生突变，表明细菌的毒力也许和耐药性相关[31]。铜绿假单胞菌耐药性和Ⅲ型分泌系统是影响其感染的关键因素，一项对铜绿假单胞菌引起感染的研究中发现，氟喹诺酮耐药铜绿假单胞菌菌株感染导致的不良后果和Ⅲ型分泌系统调节的毒力有关，研究者分析了氟喹诺酮耐药菌和敏感菌菌株的毒力，耐药菌呈现出相对较高的毒力[32]。表明喹诺酮耐药性与细菌毒力呈现共同进化的现象，可能共同广泛存在于特异性基因中，也许是逐步进化的结果。

5 小结与展望

细菌的耐药性与其毒力因素均有利于细菌菌株在不利条件下生长，毒力机制是机体特异表达的产物，有利于突破宿主的防御机制，而对抗生素的耐药则有利于病原菌在抗生素压力和苛刻的环境下存活[33]。由于抗生素的不合理使用改变了致病菌的自然进化，致使耐药菌数量增加、种类增多，而细菌耐药机制会使细菌毒力发生变化，进而影响细菌的适应性。综上所述，耐药性形成中涉及的分子机制会影响细菌的毒力，而细菌毒力是与细菌感染力和致病性强弱有关的因素，因此明确耐药菌株毒力减弱或增强的分子机制对于细菌性疾病的防治具有重要意义。参考文献:

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Progress on Molecular Mechanism of Bacterial Drug Resistance and Its Effect on Bacterial Virulence

ZHAO Qiu-yun1,YUAN Fu-wei2,LIU Rui-qi1, WANG Wei-wei1, XU Yong-ping1,ZHANG Wei-min1,QING Su-zhu1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shannxi,712100,China； 2.HenanMuxiangVeterinaryPharmaceuticalLimitedLiabilityCompany,Zhengzhou,Henan,451162,China)

The phenomenon of bacterial drug resistance has become serious gradually because of the selective pressure of antimicrobials.Studies have shown that some molecular mechanisms of bacterial resistance could cause the change of bacterial pathogenicity,which indicated the relativities between the two.In this paper,we summarized the molecular mechanisms of bacterial resistance,introduced the bacterial pathogenic process which includes the molecules closely related to drug resistance,analyzed the effects of bacterial resistance on the changes of bacterial virulence from 4 parts containing the bacterial cell wall,membrane,cytoplasm,and chromosome.We hope to find some new methods or breakthrough points to solve the difficult problems of the present serious bacterial resistance and bacterial disease prevention.

bacteria; drug resistance; molecular mechanism; virulence

2016-09-13

陕西省科技攻关项目(2014K02-05-01) ；陕西省农业财政项目(K332021402)

赵秋云(1991-)，女，安徽阜阳人，硕士研究生，主要从事基础兽医学研究。*通讯作者

S859.7

A

1007-5038(2017)02-0071-04