考马斯亮蓝法对烟草薄片涂布液中蛋白质含量的测定

杨静++白冰++王宁++张改红

摘要：采用考马斯亮蓝法对烟草薄片涂布液中的蛋白质含量进行了测定，建立了快速、灵敏的蛋白质检测方法。结果表明，蛋白质含量在14～140 μg/mL与吸光度呈良好的线性关系（R2=0.999 5），样品平均回收率为101.5%，RSD为1.4%。该方法简便、快速、准确度高、重现性好，可以作为烟草薄片涂布液及烟草料液中蛋白质测定的有效方法。

关键词：薄片涂布液；蛋白质；考马斯亮蓝法

中图分类号：Q51；S572 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）05-0946-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.05.039

Determination of Protein Content in Reconstituted Tobacco Coating Liquid by Coomassie Brilliant Blue Method

YANG Jing1，BAI Bing1，WANG Ning2，ZHANG Gai-hong1

（1.School of Food and Bioengineering， Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou 450000， China； 2.Henan Cigarette Industry Tobacco Sheet Co. Ltd.， Xuchang 461000， Henan，China）

Abstract： A rapid and sensitive Coomassie brilliant blue method was developed for protein determination in reconstituted tobacco coating liquid. The results showed that，the protein content had a good linear relationship with the absorbance in the range of 14～140 μg/mL（R2=0.999 5）. The average recovery was 101.5% and RSD was 1.4%. The method was simple，rapid，accurate and have high reproducibility，which could be used to determine the protein content in reconstituted tobacco coating liquid and tobacco sauce as an efficient method.

Key words： reconstituted tobacco coating liquid； protein； coomassie brilliant blue method

蛋白質对于烟叶的吸味品质有不利的影响，燃吸时烟叶中的蛋白质会使烟气苦味增加并有烧羽毛的气味，因此准确测定烟草中的蛋白质含量有着重要意义。国内烟草行业主要采用克达尔法及其改进方法[1，2]。

近年来，连续流动法测定蛋白质也得到了较多的应用[3-5]。为了消除可溶性氮如氨基酸、生物碱的干扰，这些方法在操作时须使用酸性溶剂将可溶性氮去除，其主要研究对象是烟草及固态烟草制品。然而对于烟草水浸提得到的产品如烟草料液、烟草薄片涂布液，其中的生物碱、氨基酸难以有效的与可溶性蛋白质分离，因此在使用上述方法测定蛋白质时，会造成严重干扰。针对这种情况，必须建立一种简便快速、选择性好、干扰小的烟草料液、烟草薄片涂布液中蛋白质含量的检测方法。

考马斯亮蓝法又称Bradford法，广泛用于食品中可溶性蛋白质的快速测定[6，7]。其基本原理是在酸性条件下考马斯亮蓝G-250选择性与蛋白质疏水基团结合，形成蓝色的蛋白质-染料复合物，在595 nm处有最大光吸收，而氨基酸、生物碱对此并无干扰[8-10]。因此本研究采用考马斯亮蓝G-250染色法测定烟草薄片涂布液中蛋白质含量，并对该方法的线性关系、精密度、重复性、稳定性、回收率进行考察，旨在探索建立一种准确快速、选择性好、成本低廉的测定烟草薄片涂布液及烟草料液中蛋白质含量的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

T-6新世纪紫外-可见分光光度计（北京普析通用），考马斯亮蓝G-250（阿拉丁），牛血清白蛋白BSA（西安国安生物科技），其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 标准蛋白溶液配置 精密称取牛血清白蛋白14.2 mg，用去离子水溶解，定容于100 mL容量瓶，制得142 μg/mL蛋白质标准溶液，置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 考马斯亮蓝G-250溶液配制 称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 mL 95%乙醇，加入85%磷酸100 mL，用去离子水定容于1 L棕色容量瓶中，制得考马斯亮蓝G-250溶液（呈棕红色），备用。

1.2.3 供试样品溶液制备 精密称取300 mg烟草薄片涂布液定容于25 mL容量瓶，制得供试样品溶液，备用。

1.2.4 绘制标准曲线 取7支10 mL具塞试管，分别精密吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL标准蛋白溶液于试管中，各管补加去离子水至1 mL，加入考马斯亮蓝G-250溶液5 mL，混匀，室温放置5 min后在595 nm处测定溶液吸光度，绘制标准曲线。

1.2.5 样品中蛋白质含量测定 取供试样品溶液 1 mL，按照“1.2.4”方法测定其595 nm处吸光度，计算供试样品中蛋白质含量。

2 结果与分析

2.1 标准曲线和回归方程的建立

以体系中蛋白质质量（μg）为横坐标x，595 nm处吸光度为纵坐标y（表1），绘制标准曲线如图1，得回归方程为，y=0.013 39+0.005 39x，R2=0.999 5，由此表明，蛋白质在14～140 μg/mL与吸光度之间符合Lamber-Beer定律。

2.2 精密度试验

精密吸取标准蛋白溶液，按照“1.2.4”方法連续测定6次吸光度，计算RSD为0.4%，表明该方法精密度良好。

2.3 重复性试验

精密吸取标准蛋白溶液6份，按照“1.2.4”方法分别测定其吸光度，计算RSD为3.3%，表明该方法重复性良好。

2.4 稳定性试验

精密吸取标准蛋白溶液，按照“1.2.4”方法每隔20 min测定一次吸光度，表明2 h之内吸光度无明显变化，RSD为0.7%。

2.5 回收率试验

精密吸取已知含量的样品溶液，分别加入一定量的标准蛋白溶液，按照“1.2.4”方法测定其吸光度，结果见表2。结果表明，样品加标回收率范围为99.5%～103.2%，平均回收率为101.5%，RSD<5%，该方法准确度较高。

2.6 样品含量测定

对3个不同样品烟草薄片涂布液进行蛋白质含量测定，每个样品3次重复，3次测定结果平均值作为实测值，结果见表3。

3 结论

建立了烟草薄片涂布液中蛋白质含量测定的考马斯亮蓝G-250染色法，该方法精密度高、稳定性和重复性好，对仪器精度要求较低。结果表明，蛋白质浓度在14～142 μg/mL时，与吸光度呈良好的线性关系。可见，该方法是一种烟草薄片涂布液中蛋白质含量测定的有效方法，同时该方法也适用于烟草料液中蛋白质含量的测定。

参考文献：

[1] YC/T 166-2003，烟草和烟草制品总蛋白质含量的测定[S].

[2] 汪长国，戴 亚，方 力，等.烟草中蛋白质测定方法的改进[J].烟草科技，2004，37（1）：19-20，35.

[3] YC/T 249-2008，烟草及烟草制品-蛋白质的测定-连续流动法[S].

[4] 瞿先中，程 涛，蒋士盛，等.连续流动分析法测定烟草中的蛋白质[J].烟草科技，2006，39（1）：41-42，53.

[5] 孔浩辉，郭 文，张心颖，等.连续流动法测定烟草中的蛋白质含量[J].烟草科技，2009，42（11）：44-46.

[6] 李志江.考马斯亮蓝G250染色法测定啤酒中蛋白质含量[J].酿酒，2008，35（1）：70-72.

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