蛋氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响

赵艳丽 陈 璐 史彬林 郭晓宇 闫素梅

(内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特010018)

蛋氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响

赵艳丽 陈 璐 史彬林 郭晓宇 闫素梅*

(内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特010018)

本试验旨在研究蛋氨酸(Met)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响，以探讨Met对乳脂合成的影响机理。将第3代BMECs随机分为6个处理(每个处理6个重复)，培养液中Met浓度分别为0.13、0.26、0.39、0.52、0.65和0.78 mmol/L。在37 ℃、5% CO2条件下培养48 h后测定BMECs内甘油三酯(TG)的含量及乳脂合成相关基因和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)与固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)蛋白的相对表达量。结果显示：Met浓度对BMECs内TG含量无显著影响(P>0.05)。0.52～0.78 mmol/L Met处理BMECs内脂肪酸结合蛋白3(FABP3)、乙酰辅酶A羧化酶A(ACACA)和PPARγ基因的相对表达量均显著高于其他处理(P<0.05)。BMECs内脂蛋白脂酶(LPL)基因的相对表达量以0.26～0.39 mmol/L Met处理较高，显著高于0.65～0.78 mmol/L Met处理(P<0.05)。脂肪酸合成酶(FASN)基因的相对表达量以0.39～0.52 mmol/L Met处理较高，且0.52 mmol/L Met处理显著高于0.13～0.26 mmol/L和0.65～0.78 mmol/L Met处理(P<0.05)。Met浓度可显著影响SREBP1和乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6(AGPAT6)基因及SREBP1和PPARγ蛋白的表达(P<0.05)，均以0.26 mmol/L Met处理的相对表达量最高。结果表明，Met浓度影响BMECs内脂肪酸摄取、从头合成的基因的表达及乳脂合成调控因子PPARγ和SREBP1的基因和蛋白的表达，Met浓度为0.26～0.52 mmol/L时对BMECs内脂肪酸从头合成及长链脂肪酸摄取的促进效果较好。

奶牛；乳腺上皮细胞；蛋氨酸；乳脂

乳脂是牛奶的重要组成成分，也是衡量乳品质的重要指标。研究表明，氨基酸(AA)作为乳蛋白合成的重要前体物，不仅影响乳蛋白的合成，也是影响乳脂合成与组成的因素之一[1]。蛋氨酸(Met)作为奶牛的必需氨基酸，在对乳蛋白合成影响的同时，对乳腺内脂肪酸的从头合成也具有显著的影响[2]。因此，深入探讨Met对乳脂合成的影响及其机理对改善乳品质有重要意义。体内研究发现，皱胃灌注40 g/d的Met后，奶牛乳腺内中短链脂肪酸(medium and short chain fatty acids,SMCFA)(C4～C14)与长链脂肪酸(long-chain fatty acids,LCFA)的含量分别增加11.1%和9.8%[2]。体外研究发现，30 μg/mL的Met上调奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)内脂肪酸从头合成基因乙酰辅酶A羧化酶α(acetyl-coenzyme A carboxylase α,ACACA)的相对表达量[3]。可见，Met影响奶牛乳脂的合成及组成，但以前的研究多偏重于Met对奶牛乳汁分泌和乳脂合成的影响效果，对于其机理探索涉及较少，有必要对此进行深入的试验研究。鉴于此，本试验以BMECs为模型，研究Met对乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响，为进一步探讨Met对BMECs内乳脂合成的影响机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

1.2 试剂配制

Met工作液的配制：试验开始前，称取0.159 7 g的Met粉末溶于20 mL DMEM/F12基础培养基中，配制成浓度为52 mmol/L的Met溶液，0.22 μm滤器过滤。以52 mmol/L的Met溶液为贮备液配制成不同Met浓度的细胞培养液，使得BMECs反应体系培养液中Met终浓度分别为0.13、0.26、0.39、0.52、0.65和0.78 mmol/L。

生长培养基的配制：在100 mL的DMEM/F12基础培养基中添加所需试剂，最终使其含10%胎牛血清、1%胰岛转铁蛋白、1 μg/mL氢化可的松、0.5%胰岛素转铁蛋白硒钠、10 ng/mL表皮生长因子、5 μg/mL催乳素、100 μg/mL链霉素、100 IU/mL青霉素和2.5 μg/mL两性霉素B。

1.3 BMECs的培养

采用胶原酶消化法培养BMECs，具体参照Sheng等[4]的方法进行。从内蒙古呼和浩特市北亚清真屠宰场选取健康泌乳的荷斯坦奶牛乳腺组织低温运回实验室。从深层取约1 cm3组织块放入3×双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)中。随后分别用3×双抗的PBS清洗3遍、75%酒精清洗30 s、1×PBS清洗3遍。剪取腺泡丰富的部位放入5 mL无菌无酶的离心管中。再将其剪成糊状后加入等体积0.5%的Ⅱ型胶原酶，37 ℃消化1 h，每20 min上下颠倒混匀1次，使其充分消化。80目滤网过滤后，1 300 r/min离心5 min，PBS冲洗细胞1次，1 300 r/min离心3 min，PBS重复冲洗2次。用生长培养基悬浮接种于25 cm2透气培养瓶中，于37 ℃、5% CO2条件下培养，直至原代细胞贴壁率达约90%后用0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液纯化和传代细胞。

1.4 试验设计

收集第3代BMECs并悬浮于生长培养基中按照试验要求的密度接种于细胞培养板上，于37 ℃、5% CO2培养24 h。试验采用单因子随机试验设计，将BMECs培养24 h后随机分为6个处理，每个处理6个重复。根据课题组前期的试验结果[5]选取不同浓度的Met，分别为0.13、0.26、0.39、0.52、0.65和0.78 mmol/L，Met的最低浓度为Rius等[6]和王新朋[7]报道中奶牛动脉血中Met浓度的5倍。BMECs贴壁率为80%～90%时，用无血清DMEM/F12培养基饥饿培养12 h后每孔加入含不同浓度Met的细胞培养液。37 ℃、5% CO2培养48 h，研究Met对BMECs内乳脂合成影响的机理。

1.5 测试指标与方法

1.5.1 BMECs内甘油三酯(TG)含量的测定

BMECs内TG含量的测定按照Ramiírez-Zacarías等[8]的方法进行，以吸光度(OD)值表示其含量。将细胞悬液以5×104个/mL的密度接种于24孔培养板，按上述试验设计培养48 h后，弃培养液，PBS漂洗2次，每孔加入4%多聚甲醛溶液0.2 mL固定细胞1 h后，PBS漂洗2次，0.5 mL油红O工作液避光浸染2 h。然后用PBS漂洗3次，晾干培养板后，加入0.3 mL异丙醇萃取30 min，用全自动酶标仪在波长为510 nm处测定其OD值。每个处理6个重复。

1.5.2 BMECs内乳脂合成相关基因表达的测定

表1 乳脂合成相关基因的引物序列

续表1基因GenesGenBank登录号GenBankaccessionNo．引物序列Primersequences(5′—3′)长度Length/bp参考文献ReferencesLPIN1DV797268F：TGGCCACCAGAATAAAGCATGR：GCTGACGCTGGACAACAGG101自行设计BTN1A1M35551F：AGGACGGACTGGGCAATTGR：GAACCCATTCTCGGGAGTCAT81Bionaz等[11]XDHBC102076F：GATCATCCACTTTTCTGCCAATGR：CCTCGTCTTGGTGCTTCCAA100自行设计

GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶 glycerol phosphate dehydrogenase；FASN：脂肪酸合成酶 fatty acid synthase；ACACA：乙酸辅酶A羧化酶α acetyl-coenzyme A carboxylase α；SCD：硬脂酰辅酶A去饱和酶 stearoyl-CoA desaturase；FABP3：脂肪酸结合蛋白3 fatty acid-binding protein 3；LPL：脂蛋白脂酶 lipoprotein lipase；PPARγ：过氧化物酶体增殖物激活受体γ peroxisome proliferator-activated receptor gamma；SREBP1：固醇调节元件结合蛋白1 sterol regulatory element binding protein 1；AGPAT6：乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 6；GPAM：线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶 mitochondrial glycerol-3-phosphate acyltransferase；LPIN1：磷脂酸磷酸酯酶 1 phosphatidic acid phosphatase 1；BTN1A1：嗜乳脂蛋白亚家族1成员1 butyrophilin subfamily 1 member A1；XDH：黄嘌呤脱氢酶 xanthine dehydrogenase。表2同 The same as Table 2。

1.5.3 BMECs内乳脂合成相关蛋白表达的测定

将细胞悬液以1×106个/mL的密度接种于25 cm2细胞培养瓶，按上述试验设计培养48 h后，弃上清，PBS清洗贴壁生长的细胞2次，加入含0.1% PMSF的RIPA细胞裂解液250 μL，4 ℃裂解5 min后收集细胞悬液，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清液检测乳脂合成相关蛋白PPARγ和SREBP1蛋白的表达。将60 μg待检测蛋白样品与5×上样缓冲液按照4∶1的比例混合，100 ℃条件下变性5 min后进行电泳，于浓缩胶上80 V电泳40 min，分离胶上120 V电泳100 min。目的蛋白经电泳分离后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。转膜完成后，用蒸馏水冲洗1 min，室温封闭1 h后，TBST洗涤3次，每次2 min。然后分别用兔抗PPARγ(1∶250)和鼠抗SREBP1(1∶50)于4 ℃孵育过夜，取出PVDF膜后TBST洗涤3次，每次5 min。用山羊抗兔二抗(1∶1 000)和山羊抗鼠二抗(1∶500)室温孵育1 h，TBST洗涤3次，每次8 min。利用ECL化学超敏显色液进行显色，凝胶成像仪上照相、分析(Tanongis-1000，上海天能生物科技公司)。图片用Quantity one软件进行灰度值分析。PPARγ和SREBP1蛋白的相对表达量采用各处理与Met浓度为0.13 mmol/L的处理的比值表示。

1.6 数据处理

所有数据通过Excel 2007进行计算和整理，采用SAS 9.0分析软件的方差分析(ANOVA)程序进行显著性检验。P<0.05表示差异显著，0.05≤P<0.10表示差异趋于显著。

2 结 果

2.1 Met对BMECs内TG含量和乳脂合成相关基因表达的影响

如表2所示，不同浓度的Met对BMECs内TG含量无显著影响(P>0.05)，从数值上看，以0.39～0.65 mmol/L Met处理TG含量较高。0.39～0.78 mmol/L Met处理BMECs内FABP3基因的相对表达量显著高于0.13～0.26 mmol/L Met处理(P<0.05)，且0.52和0.78 mmol/L Met处理显著高于0.39 mmol/L Met处理(P<0.05)。0.52 mmol/L Met处理BMECs内FASN基因的相对表达量显著高于0.13～0.26 mmol/L和0.65～0.78 mmol/L Met处理(P<0.05)。BMECs内LPL基因的相对表达量以0.26～0.39 mmol/L Met处理较高，显著高于0.65～0.78 mmol/L Met处理(P<0.05)。0.52～0.78 mmol/L Met处理BMECs内ACACA和PPARγ基因的相对表达量显著高于其他处理(P<0.05)。随着Met浓度的增加，BMECs内SREBP1和AGPAT6基因的相对表达量均先增加后降低，但各处理均高于0.13 mmol/L Met处理，同时0.26 mmol/L Met处理的SREBP1基因的相对表达量显著高于其他处理(P<0.05)。0.26 mmol/L Met处理BMECs内AGPAT6基因的相对表达量显著高于0.13 mmol/L和0.39～0.52 mmol/L Met处理(P<0.05)。不同Met浓度处理间BMECs内SCD、GPAM、LPIN1、XDH和BTN1A1基因的相对表达量均无显著差异(P>0.05)。

表2 Met对BMECs内TG含量和乳脂合成相关基因表达的影响

同行数据肩标相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

Values in the same row with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 Met对BMECs内乳脂合成相关蛋白表达的影响

如表3和图1所示，0.26～0.78 mmol/L Met处理BMECs内PPARγ和SREBP1蛋白的相对表达量显著高于0.13 mmol/L Met处理(P<0.05)，尤以0.26 mmol/L Met处理最高，显著高于其他处理(P<0.05)。0.39～0.78 mmol/L Met处理间BMECs内PPARγ蛋白的相对表达量无显著差异(P>0.05)；0.39 mmol/L Met处理BMECs内SREBP1蛋白的相对表达量显著高于0.52～0.78 mmol/L Met处理(P<0.05)，0.78mmol/L Met处理SREBP1蛋白的相对表达量最低，显著低于其他各处理(P<0.05)。

表3 Met对BMECs内乳脂合成相关蛋白表达的影响

3 讨 论

Met作为奶牛的必需氨基酸，体内研究发现其在对乳蛋白合成产生影响的同时，可引起奶牛乳腺内SMCFA(C4～C16)的从头合成与LCFA含量的增加[2]；体外的研究资料报道，30 μg/mL的Met上调BMECs内脂肪酸从头合成基因ACACA的表达[3]。这些研究提示Met对乳脂的合成有一定的影响，但其影响机理尚不清楚。本研究在前人研究的基础上并结合本课题组前期的结果[5]设计了不同的Met浓度梯度，从乳脂合成相关基因和蛋白表达的角度探讨Met对乳脂合成的影响。由于培养液中与体内相似浓度的必需氨基酸对奶牛乳腺内的代谢的影响非常小，只有培养液中必需氨基酸浓度为正常血浆浓度的数倍以上才会产生较显著的影响[13]，本研究中Met的最低浓度为Rius等[6]和王新朋[7]报道的奶牛动脉血中Met浓度的5倍以上。LPL和FABP3是参与哺乳动物多种组织中LCFA摄取与细胞内转运的重要基因[14]。LPL决定脂肪细胞的大小和脂肪的累积程度，可将血液中的乳糜微粒和极低密度脂蛋白携带的TG催化水解释放出甘油和脂肪酸[15]，供组织储存和利用。FABP3主要与细胞内LCFA的转运有关。本研究结果得出适宜浓度的Met对BMECs内的FABP3和LPL基因的相对表达量有显著的促进作用，说明Met对BMECs内LCFA的摄取及转运有一定促进效果。

GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶 glycerol phosphate dehydrogenase；PPARγ：过氧化物酶体增殖物激活受体γ peroxisome proliferator-activated receptor gamma；SREBP1：固醇调节元件结合蛋白1 sterol regulatory element binding protein 1。

SREBP1属于核转录因子家族，是脂肪合成基因的重要转录调控因子，可以调节脂肪酸合成相关基因的表达。FASN和ACACA是参与奶牛乳脂肪酸从头合成过程的2个关键酶，其中ACACA是脂肪酸从头合成的一种限速酶，催化乙酰-辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A。在泌乳期间乳腺内FASN编码的蛋白FASN调控SMCFA(C4～C16)的合成[16]。SREBP1正向调控FABP3、ACACA和FASN基因的表达，进而调节脂肪酸的转运和从头合成。SREBP1基因的功能或表达受PPARγ的调控[11]。同时，PPARγ可以正向调控奶山羊乳腺上皮细胞内ACACA、FASN、FABP3、AGPAT6、SREBP1基因[17]及脂肪细胞中LPL基因的表达[18]。研究发现生长培养基中添加Met可上调BMECs内ACACA基因的表达[3]；饲喂青贮饲料的奶牛皱胃灌注Met后，乳中SMCFA(C4～C14)的从头合成随着Met灌注量的增加而增加，灌注量为40 g/d时C4～C14含量增加11.1%，但C16含量变化不显著[2]。本试验结果表明，适宜浓度的Met可促进SREBP1和PPARγ的基因和蛋白的表达，上调FASN和ACACA基因的表达，即Met可能通过上调SREBP1和PPARγ基因和蛋白表达，进而上调FASN和ACACA基因的表达，从而促进SMCFA的合成。

TG在乳脂中的含量为98%，其含量高低直接反映乳脂肪的合成。本试验结果得出，适宜浓度的Met促进SMCFA的从头合成及BMECs内LCFA的摄取与转运，但对TG合成的影响不显著，其机制尚不清楚。有研究发现奶牛乳腺组织内SCFA进入TG合成途径受二酰基甘油酰基转移酶1(DGAT1)基因调控，DGAT1与TG合成相关的其他基因相比，对乳脂合成的影响较小，但对TG合成仍非常重要[11]。C>10的脂肪酸被长链酰基辅酶A合成酶家族成员1(ACSL1)激活后与FABP3结合，然后进入TG合成[11]，ACSL1的过表达可促进LCFA进入TG合成[19]。本研究发现Met可上调PPARγ和FABP3基因的表达，但对TG合成的影响不显著。BMECs内激活PPARγ可上调DGAT1基因的表达，但不影响ACSL1基因的表达[20]，这说明Met对TG合成的影响可能与ACSL1有关，但相关研究报道较少，有待于进一步研究探讨。GPAM、AGPAT6和LPIN1是参与TG合成的主要基因，同时其编码的蛋白也是参与乳脂合成的关键酶[19]。GPAM催化脂酰辅酶A结合到甘油-3-磷酸sn-1位点合成溶血磷脂酸，AGPAT6催化第2个脂酰辅酶A结合到甘油-3-磷酸sn-2位点形成磷脂酸(PA)。LPIN1能转移磷酸基团，将PA转变成二酰甘油，之后，第3个脂酰辅酶A酯化到甘油的sn-3位点合成TG。XDH在乳脂肪球和细胞顶膜偶联过程中起重要作用，BTN1A1在乳腺细胞分泌时帮助形成乳脂滴。本试验结果得出，Met对BMECs内GPAM、LPIN1、BTN1A1和XDH基因的表达以及TG含量均无显著影响，但适宜浓度的Met可显著促进AGPAT6基因的表达。一项泌乳小鼠的研究发现，敲除AGPAT6基因后不能合成乳脂，但在富含AGPAT6基因的细胞膜内，以sn-1-酰基甘油和乙酰辅酶A为底物的研究中，未检测到GPAM和AGPAT6活性的增加[21]。也有研究发现AGPAT6是一种微粒体甘油-3-磷酸脂酰转移酶(GPAT)，也被称为GPAT4[22]，且过表达小鼠GPAT4基因不影响TG的含量[23]，这说明TG的合成不仅在转录水平受到GPAM和AGPAT6基因表达的影响，可能还受到其编码的蛋白的表达量及活性的影响。由此推测本试验结果得出的Met显著促进AGPAT6基因的表达但对TG的合成无显著影响的结果可能与GPAM和AGPAT6编码的蛋白的表达量及活性有关，需要进一步探讨。

综合TG合成、乳脂合成相关基因及SREBP1和PPARγ蛋白的表达结果可以看出，Met的浓度影响脂肪酸摄取及从头合成。0.26～0.78 mmol/L Met处理BMECs内SREBP1和PPARγ蛋白的相对表达量均较高。随着Met浓度的增加，BMECs内FABP3和ACACA基因的相对表达量增加，尤以0.52～0.78 mmol/L Met处理的相对表达量较高，但高浓度(0.65～0.78 mmol/L)Met抑制LPL和FASN基因的表达。综合乳脂合成的多项指标，Met浓度以0.26～0.52 mmol/L为宜。另外，本研究也通过回归分析得出，ACACA和PPARγ基因的表达随Met浓度的增加而增加，Met浓度分别达到0.73、0.42、0.55、0.53、0.46和0.44 mmol/L时，FABP3、FASN和AGPAT6基因的表达、PPARγ蛋白的表达、SREBP1基因和蛋白的表达达到最佳，但由于0.73 mmol/L的Met抑制LPL基因的表达，综合这些结果得出，Met最佳浓度为0.42～0.55 mmol/L。在实际生产中，NRC(2001)推荐泌乳奶牛Met的供给量应占到饲粮代谢蛋白质的2.4%，且有关Met对奶牛乳脂的研究多侧重于对乳脂率和乳脂量方面的影响，而针对影响机理的研究涉及很少，因此，本研究利用体外法得出的结果还需要在体内进一步验证。

4 结 论

Met浓度影响BMECs内脂肪酸摄取、从头合成的基因表达及乳脂合成调控因子PPARγ和SREBP1基因和蛋白的表达，Met浓度为0.26～0.52 mmol/L时，对BMECs内脂肪酸从头合成及长链脂肪酸摄取的促进效果较好。

[1] MAXIN G,RULQUIN H,GLASSER F.Response of milk fat concentration and yield to nutrient supply in dairy cows[J].Animal:An International Journal of Animal Bioscience,2011,5(8):1299-1310.

[2] VARIKKO T,VANHATALO A,JALAVA T,et al.Lactation and metabolic responses to graded abomasal doses of methionine and lysine in cows fed grass silage diets[J].Journal of Dairy Science,1999,82(12):2659-2673.

[3] 李喜艳.奶牛乳腺上皮细胞中赖氨酸蛋氨酸配比模式对酪蛋白合成的影响及机理研究[D].硕士学位论文.北京:中国农业科学院,2011.

[4] SHENG R,YAN S M,QI L Z,et al.Effect of the ratios of acetate and β-hydroxybutyrate on the expression of milk fat-and protein-related genes in bovine mammary epithelial cells[J].Czech Journal of Animal Science,2015,60(12):531-541.

[5] 常晨城.蛋氨酸及含蛋氨酸二肽对奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白合成相关基因表达的影响[D].硕士学位论文.呼和浩特:内蒙古农业大学,2015.

[6] RIUS A G,APPUHAMY J A D R N,CYRIAC J,et al.Regulation of protein synthesis in mammary glands of lactating dairy cows by starch and amino acids[J].Journal of Dairy Science,2010,93(7):3114-3127.

[7] 王新朋.阴外动脉灌注氨基酸和脂肪酸对奶牛乳腺蛋白质合成和氨基酸摄取规律的影响[D].硕士学位论文.呼和浩特:内蒙古农业大学,2015.

[9] ZHOU Y,AKERS R M,JIANG H.Growth hormone can induce expression of four major milk protein genes in transfected MAC-T cells[J].Journal of Dairy Science,2008,91(1):100-108.

[10] QI L Z,YAN S M,SHENG R,et al.Effects of saturated long-chain fatty acid on mRNA expression of genes associated with milk fat and protein biosynthesis in bovine mammary epithelial cells[J].Asian-Australasian Journal of Animal Sciences,2014,27(3):414-421.

[11] BIONAZ M,LOOR J J.Gene networks driving bovine milk fat synthesis during the lactation cycle[J].BMC Genomics,2008,9:366.

[12] 张养东.脂多糖对泌乳奶牛乳脂肪和乳蛋白影响及其机理研究[D].博士学位论文.哈尔滨:东北农业大学,2011.

[13] HANIGAN M D,CROMPTON L A,METCALF J A,et al.Modelling mammary metabolism in the dairy cow to predict milk constituent yield,with emphasis on amino acid metabolism and milk protein production:model construction[J].Journal of Theoretical Biology,2001,213(2):223-239.

[14] LRHNER R,KUKSIS A.Biosynthesis of triacylglycerols[J].Progress in Lipid Research,1996,35(2):169-201.

[15] BONNET M,LEROUX C,CHILLIARD Y,et al.Rapid communication:nucleotide sequence of the ovine lipoprotein lipase cDNA[J].Journal of Animal Science,2000,78(11):2994-2995.

[16] WAKIL S J.Fatty acid synthase,a proficient multifunctional enzyme[J].Biochemistry,1989,28(11):4523-4530.

[17] SHI H,LUO J,ZHU J,et al.PPARγ regulates genes involved in triacylglycerol synthesis and secretion in mammary gland epithelial cells of dairy goats[J].PPAR Research,2013,2013:310948.

[18] DESVERGNE B,MICHALIK L,WAHLI W.Transcriptional regulation of metabolism[J].Physiological Reviews,2006,86(2):465-514.

[19] BIONAZ M,LOOR J J.ACSL1,AGPAT6,FABP3,LPIN1,andSLC27A6 are the most abundant isoforms in bovine mammary tissue and their expression is affected by stage of lactation[J].The Journal of Nutrition,2008,138(6):1019-1024.

[20] KADEGOWDA A K G,BIONAZ M,PIPEROVA L S,et al.Peroxisome proliferator-activated receptor-γ activation and long-chain fatty acids alter lipogenic gene networks in bovine mammary epithelial cells to various extents[J].Journal of Dairy Science,2009,92(9):4276-4289.

[21] BEIGNEUX A P,VERGNES L,QIAO X,et al.Agpat6—a novel lipid biosynthetic gene required for triacylglycerol production in mammary epithelium[J].The Journal of Lipid Research,2006,47(4):734-744.

[22] CHEN Y Q,KUO M S,LI S,et al.AGPAT6 is a novel microsomal glycerol-3-phosphate acyltransferase[J].The Journal of Biological Chemistry,2008,283(15):10048-10057.

[23] NAGLE C A,VERGNES L,DEJONG H,et al.Identification of a novel sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase isoform,GPAT4,as the enzyme deficient inAgpat6-/-mice[J].The Journal of Lipid Research,2008,49(4):823-831.

*Corresponding author, professor, E-mail: yansmimau@163.com

(责任编辑 菅景颖)

Effects of Methionine on Expression of Genes and Proteins Related with Milk Fat Synthesis in Bovine Mammary Epithelial Cells

ZHAO Yanli CHEN Lu SHI Binlin GUO Xiaoyu YAN Sumei*

(CollageofAnimalScience,InnerMongoliaAgricultureUniversity,Hohhot010018,China)

This experiment was to study the effects of methionine (Met) on expression of genes and proteins related with milk fat synthesis in bovine mammary epithelial cells (BMECs), in order to investigate the mechenism of Met regulating milk fat synthesis. The third generation of BMECs were divided into six treatments with six replicates per treatment, and cultured in culture mediums with 0.13, 0.26, 0.39, 0.52, 0.65 and 0.78 mmol/L Met, respectively. The triglyceride (TG) content, the relative expression levels of genes related with milk fat synthesis, as well as the protein relative expression levels of peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPARγ) and sterol regulatory element binding protein 1 (SREBP1) in BMECs after 48 h incubation at 37 ℃ and 5% CO2were detected. The results showed that Met concentration had no significant effect on TG content in BMECs (P>0.05). The gene relative expression levels of fatty acid-binding protein 3 (FABP3), acetyl-CoA carboxylase A (ACACA) andPPARγin BMECs of 0.52 to 0.78 mmol/L Met treatments were significantly higher than those of other treatments (P<0.05). The gene relative expression level of lipoprotein lipase (LPL) in BMECs of 0.26 to 0.39 mmol/L Met treatments was higher, which significantly higher than that of 0.65 to 0.78 mmol/L treatments (P<0.05). The gene relative expression level of fatty acid synthase (FASN) in BMECs of 0.39 to 0.52 mmol/L Met treatments was higher, and it of 0.52 mmol/L Met treatment was significantly higher than that of 0.13 to 0.26 mmol/L and 0.65 to 0.78 mmol/L Met treatments (P<0.05). Met concentration could significantly affect the gene expression ofSREBP1 and 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 6 (AGPAT6) and the protein expression of SREBP1 and PPARγ in BMECs (P<0.05), and the highest relative expression levels of them were all observed in 0.26 mmol/L Met treatment. These results demonstrate that Met concentration affects the expression of genes related with long-chain fatty acids uptake anddenovosynthesis of fatty acids, as well as the gene and protein expression ofSREBP1 andPPARγwhich were milk fat synthesis regulatory factors in BMECs. Met with the concentrations of 0.26 to 0.52 mmol/L can produce the better effects for long-chain fatty acids uptake anddenovosynthesis of fatty acids in BMECs.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(3)：961-969]

dairy cow; bovine mammary epithelial cells; methionine; milk fat

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.03.029

2016-08-30

国家奶业“973计划”项目(2011CB1008003)

赵艳丽(1986—)，女，陕西榆林人，博士研究生，从事奶牛乳腺上皮细胞内乳脂乳蛋白合成调控研究。E-mail： ylzhao2010@163.com

*通信作者:闫素梅，教授，博士生导师，E-mail： yansmimau@163.com

S827

A

1006-267X(2017)03-0961-09