转基因植物生产疫苗和药物的研发进展

刘蓉蓉

（中国农业科学院科技管理局，北京 100081）

转基因植物生产疫苗和药物的研发进展

刘蓉蓉

（中国农业科学院科技管理局，北京 100081）

与传统的生产方式相比，以转基因植物作为生物反应器生产药用蛋白和疫苗，被认为是成本低廉、安全便捷的技术途径。目前，若干以转基因植物生产的药用蛋白已通过行政审批准予上市，一批转基因植物表达的人用或畜禽用疫苗也进入临床试验。综述了转基因植物生产疫苗和药用蛋白的研发进展与代表性案例，讨论了目前面临的问题与挑战，展望了未来技术发展方向。

植物生物反应器；疫苗；药用蛋白；表达系统

天然来源的药用蛋白往往因提纯成本高而导致价格昂贵，疫苗和重组蛋白则需建立人工表达系统来生产。传统的生产方式主要包括细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞等系统，但这些方式都有各自的缺点，如微生物细胞无法对蛋白进行哺乳动物的糖基化修饰或正确的折叠组装，动物细胞表达系统成本高且有污染病原的风险等。理想的蛋白表达系统必须能生产有功能的产物、生产成本低、产物易于纯化、生产耗时短。近年来，转基因植物表达药用蛋白（Plant-made pharmaceuticals，PMP）的新技术平台获得了广泛关注［1］。

1 转基因植物生产疫苗和药物研发概述

与其他几种表达系统相比，以转基因植物作为生物反应器生产重组蛋白被认为具有突出优点：方法简单、成本低廉、易于规模化生产、储藏和运输方便等，既能对表达蛋白进行翻译后折叠和糖基化修饰，与通常使用的哺乳细胞、大肠杆菌、酵母表达系统相比，又没有污染人类病原或毒素的风险，成为表达药用蛋白的理想选择［2］。

1986年研究者将人生长激素基因引入烟草，获得了表达产物，从此开启了PMP的研发工作。1989年研究者首次在烟草中成功表达了人免疫球蛋白G（IgG），证明植物中能够合成并正确组装这种多亚基的糖蛋白。首先实现商业化生产的PMP是以色列药品研发公司Protalix开发的在胡萝卜细胞中表达的葡糖脑苷脂酶，于2012年美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市，用于治疗β-葡萄糖脑苷脂酶减少或缺乏引起的一种遗传代谢病——高雪氏病（Gaucher’s disease），其价格要比天然来源的药物更便宜。

在植物可食部分表达疫苗（被称为“可食疫苗”或“口服疫苗”，Edible vaccines）是PMP领域的研发热点之一。传统疫苗生产和纯化过程较为复杂和昂贵，在运输和储存过程中必须冷藏，注射免疫的方式进一步增加了成本，需要专业人员进行注射接种，存在交叉感染的风险，具有潜在的安全性问题。用转基因植物生产疫苗则具有可当地种植、常温储藏的天然优势，将免去或部分免去蛋白纯化的花费，摒弃注射方式，也不存在弱毒疫苗毒性恢复的潜在风险。更为重要的是，“可食疫苗”食用后可同时引起粘膜免疫反应与血清免疫反应。在消化道内，植物细胞壁能够保护疫苗抗原不被消化酶降解，直到肠道微生物降解植物细胞壁后，抗原被释放出来，引发免疫反应。表达疫苗或药用蛋白的植物细胞在冻干后可在室温保存多年，是产生黏膜免疫的经济可行的方法。将抗原决定簇蛋白与穿黏膜载体（如霍乱毒素B亚基，CTB；大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基，LTB）融合表达，重组蛋白能够有效地穿过肠道上皮细胞而进入循环或免疫系统，可提高抗原运送至免疫系统的效率，促进了口服疫苗的研发［3］。

2 几种主要的表达技术系统

2.1 转基因植株表达

通过农杆菌介导、基因枪等方法将外源基因整合入植物细胞核，可使外源重组蛋白质连续稳定合成。根据信号肽的有无，表达蛋白可以存储在不同的细胞器内或分泌至胞外。这种表达方式的优点是蛋白质能够进行完整的翻译后修饰，但外源基因容易受到基因沉默、位置效应（外源基因的表达因插入位置不同而变化的现象）等的影响，表达量较低，存在转基因安全性的问题。在目前研发的产品中，主要受表达量低的因素限制，还没有通过临床一期试验的例子。通过位点特异性同源重组，将外源基因插入植物叶绿体基因组中，可使目标蛋白在叶绿体内积累。植物细胞中叶绿体基因组的数量可达上万拷贝，这可极大提高外源基因的表达量。例如，在叶绿体基因组中引入人生长激素基因时，表达量能达到细胞核转化的百倍以上；通过遗传改造的表达系统，表达量甚至可高达可溶性蛋白总量的72%［4］。引入叶绿体基因组的外源基因没有核转基因中经常发生的位置效应，也不会发生基因沉默。在开花前收获植株，能够防止通过花粉或种子发生转基因漂移。采用多顺反子表达的策略，用一个启动子能够表达多个外源基因。脊髓灰质炎、疟疾、肺结核、轮状病毒、猪流感等多种病毒的抗原都在叶绿体中成功获得了高表达［5］。

2.2 瞬时表达

以农杆菌接种法（Agroinoculation）或农杆菌渗入法（Agroinfiltration）介导基因瞬时表达是近年来发展起来的表达技术，是植物遗传转化与植物病毒学技术的融合。首先构建携带病毒表达载体的农杆菌T-DNA，通常利用花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus，CMV）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）等作为载体，将重组蛋白基因与病毒衣壳蛋白融合，或用衣壳蛋白启动子启动重组蛋白基因。通过植物叶片气孔注射或真空渗入的方法，使农杆菌进入植物叶片细胞间隙，借助农杆菌侵染作用使病毒DNA载体有效运输到植物细胞中。病毒载体在植物细胞中大量复制，几天之内就能表达大量的外源蛋白，最高表达量可达总可溶蛋白的27.6%。采用农杆菌渗入法瞬时表达可提高表达量，显著缩短植物处理过程，降低下游成本［6，7］。以病毒基因组为框架的表达载体构建是瞬时表达技术系统的关键。烟草花叶病毒和马铃薯X病毒载体能够实现外源基因的大量表达，但由于是RNA病毒，导致同时表达多个蛋白的效率较低；双生病毒载体表达系统能够表达较大的外源蛋白；烟草脆裂病毒载体表达系统适用于基因沉默和在植物根部表达。随着未来研发的深入，将有望创造出融合不同优点的新的病毒表达载体。

2.3 悬浮细胞表达

将农杆菌转化形成的植株或植物愈伤组织细胞制备成悬浮细胞，能够较为容易的在发酵罐中进行扩大生产。2006年美国农业部批准的第一例禽用新城疫病毒疫苗就采用了烟草悬浮细胞表达系统。2012年FDA批准的首例人用药用蛋白——葡糖脑苷脂酶是就在胡萝卜细胞中表达的。此外，还在水稻悬浮细胞中获得了表达量为5.1 μg/mg的猪流感病毒E2糖蛋白，口服后可引发小鼠和猪的黏膜免疫与细胞免疫反应。但以该系统生产的产品仍需经过较为复杂的下游纯化过程和低温无菌储存运输，其成本相对较高，并没有完全发挥出植物生物反应器的优越性。

3 转基因植物表达疫苗与药用蛋白的代表性研发案例

迄今为止，一批重组抗体、抗原、疫苗、医用或药用蛋白都在转基因植物中获得了表达。除烟草外，生菜、番茄、胡萝卜、大豆、马铃薯、苜蓿、水稻及玉米等植物常被用作表达系统［8］。

3.1 疫苗

首例植物来源的口服疫苗早在1995年即研发成功，是在烟草和马铃薯中表达的大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基LTB，饲喂小鼠后能够引起血清IgG和分泌型IgA合成。此后，马铃薯块茎表达的诺如病毒衣壳蛋白VP1、马铃薯和玉米表达的大肠杆菌毒素疫苗、水稻表达的霍乱疫苗等都进入了临床一期试验，在被试者体内引发了血清免疫。美国陶氏益农（Dow AgroSciences）公司研发的新城疫疫苗2006年获得USDA许可，是获得许可的第一个植物来源疫苗，然而并没有实现商业化生产。

流感病毒血凝素（HA）抗原变异率高，使流感成为威胁世界公共健康最重要的疾病之一。HA是流感病毒表面的糖蛋白，在病毒感染和致病性方面起着关键作用，也是引起宿主体内保护性免疫反应的主要抗原。高致病性禽流感H5N1毒株不仅在家禽中引起大流行，也严重威胁全球人类健康。为预防畜禽传染性疾病爆发，通常需要进行大规模的免疫接种，植物来源的疫苗为控制禽流感提供了理想的解决方案。在拟南芥中表达禽流感H5N1毒株的HA，可获得140 μg/g 鲜重的高表达量。叶片冻干后与免疫助剂同时饲喂小鼠，不仅能诱导合成HA特异性的IgA和IgG，还能产生中和抗体并引发细胞免疫反应，显示出良好的免疫保护效果［4］。美国Medicago公司生产的H5N1型禽流感疫苗已完成临床二期试验。

在一种转基因牧草Stylosanthes guianensis中表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1，将植物原料作为饲料添加剂饲喂小鼠，首次实现了针对口蹄疫的口服免疫。也有研究者在转基因水稻、烟草、番茄、苜蓿及其他牧草植物中表达口蹄疫病毒的衣壳前体多肽，成功引发了口服免疫反应［9］。

在番茄根毛系统中表达的狂犬病毒核蛋白能够在小鼠中引发免疫反应，并对病毒产生抗性；利用苜蓿花叶病毒瞬时表达体系，采用农杆菌渗入法在菠菜中瞬时表达的狂犬疫苗进入临床一期试验，能够在被试者体内产生中和抗体。

植物表达口服疫苗目前面临的主要技术问题是免疫耐受。常规注射用疫苗通常要同时使用免疫刺激的助剂，但口服疫苗由于缺乏免疫刺激而影响免疫效果，或产生免疫耐受。不过从另一个方面来看，抗原引起的特异性免疫耐受则为抗过敏口服疫苗提供了一个新的技术途径。将日本雪松（Japanese cedar）花粉过敏原Cry j1和Cry j2基因在水稻胚乳中表达，给花粉过敏的小鼠饲喂转基因稻米，在体内引发免疫耐受，能够抑制特异性的抗原IgE和细胞因子反应，血清中的组胺合成和打喷嚏等症状也得到抑制，表现出抗过敏的效果［10］。然而，自首例植物来源的口服疫苗诞生20余年来，尚没有一个产品实现产业化应用。

3.2 抗体

欧洲科学家在转基因烟草中表达了中和人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）的人单克隆抗体2G12，欧盟以2G12作为案例，通过了植物生产重组药用蛋白的标准化生产规程，包括植物转化与筛选、种子库构建、遗传稳定性的保证、植株均一性、种植与收获等［11］。德国批准了该转基因抗体的临床一期试验，并未发现明显的安全问题。这是首例获准进入临床试验的转基因植物表达的单克隆抗体，是PMP商业化进程中里程碑式的事件［12］。

埃博拉病毒引起的埃博拉出血热是死亡率很高的烈性传染病。美国Mapp公司研发了一种名为ZMapp 的试验性生物药物，以转基因烟草表达的3种抗埃博拉病毒的人鼠嵌合单克隆抗体mAbs进行“鸡尾酒”疗法。2014年8月在线发表于《Nature》上的一项研究论文中指出，ZMapp治愈了全部18只感染埃博拉病毒的恒河猴；在尚未开展临床试验的情况下，同年在利比里亚治愈了2名感染病毒的美国医疗援助人员，为抗埃博拉药物研发带来了希望［13-14］。

3.3 其他药物蛋白

许多医用或药用蛋白都在转基因植物中成功表达，包括人生长激素、血清白蛋白、血红蛋白、α-干扰素、白介素、促红细胞生成素、胰蛋白酶抑制剂等。

生菜被认为是生产PMP的理想植物。在转基因生菜中表达与CTB融合的凝血因子9，在人工控制的环境和条件下生长，收获生菜叶片后进行冻干，可获得约1 mg/g的高表达量。融合蛋白折叠和翻译后修饰正确，在室温可保存约2年，饲喂小鼠能够有效地引发特异性免疫反应。

Griffithsin（GRFT）是一种来源于红色海藻、由121个氨基酸组成的外源凝集素，由于具有针对HIV的抗病毒活性而被当做治疗艾滋病的候选药物。GRFT在大肠杆菌中获得了成功表达，但对于藻类蛋白来说，植物细胞是更为适宜的表达系统。通过农杆菌介导的瞬时表达技术，以改进后的重组烟草花叶病毒作为表达载体，烟草中GRFT表达量可高达60%-90%［7］。

Exendin-4（EX4）是一种有效的促胰岛素生成剂，被用作临床治疗II型糖尿病的药物，但使用中需要低温储存和腹部注射。CTB融合的EX4在转基因植物中表达，口服融合蛋白降低血糖的作用与皮下注射EX4相当［15］。

缺乏α葡萄糖苷酶（Acid alpha glucosidase，GAA）可导致庞培氏病（Pompe disease），使组织中糖原累积，是引起婴儿心脏迅速增大的疾病之一。尽管向患者注射重组人GAA的酶替代疗法具有临床疗效，但可能在体内产生针对重组GAA的抗体而影响治疗效果。在转基因烟草叶绿体中表达GAA，再以转基因叶片饲喂疾病模型小鼠，即使很低的剂量也可产生口服免疫耐受，显著抑制小鼠体内GAA抗体的产生。这一结果显示转基因植物表达的药用蛋白可以借助免疫耐受作用在疾病治疗方面发挥作用［16］。

4 制约PMP产业化的问题与挑战

4.1 表达量及均一性控制

口服疫苗可同时引发黏膜免疫和系统免疫，但与传统免疫方式相比，在黏膜免疫过程中抗原不穿过上皮细胞，在消化系统中可能会被酸和酶类降解，因此需要高得多的抗原剂量。早期研发工作中，制约植物疫苗研发进程的主要因素就是表达量过低，导致下游分离纯化过程成本过高。虽然叶绿体表达系统可显著提升蛋白表达量，但许多植物可食部分缺乏叶绿体，制约了该技术的应用。由此看来，农杆菌介导的瞬时表达法、以生菜为宿主的叶绿体转化法是具有优势的技术途径，但是在植物可食部位高表达重组蛋白的技术途径仍不完善。此外，由于在果实和蔬菜中表达的重组蛋白量难以控制，如果不进行表达产物分离纯化的话，需要仔细测定不同植株表达量的差异以确定合理的服用量，这也导致生产成本大幅上升。因此，通过冻干的方式控制计量是一条可行的技术路线。

4.2 蛋白质的翻译后折叠与修饰

抗原蛋白在翻译后是否折叠为正确的三维构象并进行正确的二硫键、糖基化等修饰，对其抗原活性至关重要。当蛋白质三维构象不正确时，细胞内质网中就会启动降解机制，将蛋白质运至细胞质中进入蛋白酶降解途径。植物蛋白质的糖基化与哺乳动物不同，植物细胞中蛋白质糖基化发生在内质网和高尔基体中，N-连接糖基化主要是α（1，3）-海藻糖和β（1，2）-木糖，而哺乳动物主要是α（1，6）-海藻糖和β（1，4）-半乳糖和唾液酸，糖基化修饰的差异可能引发过敏性反应。因此，要根据表达产物的来源和特性仔细设计植物表达载体与技术方案，并对重组蛋白的免疫原性和致敏性进行细致检测［17］。

4.3 免疫耐受

口服免疫耐受是生物体肠道黏膜为避免对食物中的抗原产生炎症反应的免疫抑制机制，但详细机理仍不十分清楚。传统疫苗通过助剂作为致敏因子（Priming）启动并增强宿主免疫反应，而口服免疫的方式缺乏致敏反应，可能降低免疫反应的效果或引发免疫耐受，是口服疫苗研发中必须高度关注的问题。研究显示，口服抗原的频率是影响免疫耐受的关键因素［16］。这一现象使开发PMP特别是口服疫苗需要考虑的因素变得更为复杂

4.4 上游和下游的高成本

以植物作为生物反应器生产PMP的核心优势在于成本低廉，但这仅指种植植物的生产成本。通常种植成本只构成总成本的有限部分，而建立适合的技术途径、优化表达载体、获得转基因植物等“上游”环节和建立良好生产规范（Good manufacturing practice，GMP）、提取纯化表达产物、产物质量控制等“下游”环节可能占成本很大的比重。有研究表明，植物表达药用蛋白的纯化成本可占到总成本的65%-95%。采用悬浮细胞系统尽管能简化表达产物提取纯化过程，但生产过程成本又会相应增加，产品也需要低温无菌储存和运输。基于这些综合性的原因，目前为止PMP研发工作能够成功商业化的比例并不高。

4.5 管理框架缺失

在从实验室进入批量生产时遇到的主要挑战，是生产过程的管理需求和表达蛋白的质量控制。与疫苗和药物生产所需要的高度重复性、标准化和质量控制的需求相比，大田生产植物的过程管理是产业化中必须考虑的问题。表达药用蛋白或疫苗的转基因植物应当以标准化的程序和方式来种植，以保证蛋白持续稳定的表达。到目前为止通过许可的植物来源的治疗用蛋白为数寥寥，针对此的管理框架近年来才初步建立，与哺乳动物细胞和微生物生物反应器相比，相关技术规程、管理规定和政策还非常不完善，特别是用完整的植株表达药用蛋白面临着更多的管理方面的新问题。

5 展望

针对上述问题与挑战，未来的技术发展将更加着眼于开发出能够临床应用的PMP产品，解决当前制约性的关键问题。一是通过改进表达技术体系，不断提高重组蛋白表达量。例如，选择合适的表达载体与表达系统，使用组织或器官特异性启动子，优化密码子，采用信号肽将蛋白运送至内质网以促进翻译后加工等；二是确保翻译后折叠与修饰。对于分泌蛋白来说，未来需要进一步研究细胞降解未正确折叠蛋白质的分子机理，通过分子手段保证蛋白质正确折叠，提高累积量；三是优化疫苗的免疫策略，避免口服免疫耐受。需要在大量实验研究的基础上，优化抗原递送方式、服用量与服用频率，确定合适的抗原组成，可同时服用黏膜助剂，解决好引发免疫与口服耐受间的关系问题，并保证抗原在消化道内的稳定性；四是简化下游操作。继续探索完善在植物可食部分表达重组蛋白的技术手段，实现表达蛋白不纯化而直接食用或部分纯化，大幅降低生产成本。

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（责任编辑 李楠）

Research and Development Progress on Plant-made Pharmaceuticals

LIU Rong-rong
（Department of Science and Technology Management，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Compared with the traditional production methods，the use of transgenic plants as bioreactor for the production of pharmaceutical proteins and vaccines is considered to be low-cost，safer and more convenient. At present，a number of plant-made pharmaceutical proteins have been approved for commercialization，while a group of plant-made vaccines have entered clinical trials. Research and development of plant-made vaccines and pharmaceutical proteins are reviewed，main problems and challenges are discussed，and the future technology development is prospected.

plant bioreactor；vaccine；pharmaceutical protein；expression system

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0177

2017-03-09

刘蓉蓉，女，博士，研究方向：农业科技管理；E-mail：liurongrong@caas.cn