颌骨组织工程血管化的研究进展*

杨晓彬，周苗

(广州医科大学附属口腔医院，广州口腔病研究所，口腔医学重点实验室，广州 510140)

1 引 言

血管化是颌骨组织工程的关键环节。血管化能为支架内部的种子细胞提供氧气等营养物质并及时排出代谢产物，还可将各种细胞成分运送至支架内参与新骨的生成，对修复大块颌骨缺损极为重要。由于颌骨缺损常与口腔相通，容易污染，组织工程构建物早期快速的血管化有助于提升其抗感染能力、存活率和修复缺损的成功率。目前促进组织工程颌骨血管化的方法包括应用血管内皮细胞、复合促血管生长因子、优化支架的成分与外形及内部结构设计、采用外科手段等[1]，本研究将以上促血管化手段分为体内外两类，分述如下。

2 体外手段

组织工程的经典模式是构建种子细胞-细胞因子-支架材料复合物，因此，体外构建血管化主要围绕着对这三者的调控所进行。

2.1 优化支架的成分、内部结构与外形

支架的成分、内部结构和外形与血管化密切相关，首先，采用不同成分结合的复合材料有利于突破单一成分性能的局限，因而获得了更为广泛的应用，Yang等采用天然壳聚糖和β-TCP复合物修复比格犬节段骨缺损，观察到比单一β-TCP更好的细胞黏附效果，也获得更好的血管化[2]。除了支架本身对血管化构成影响外，还可以复合一些元素、药物等加快血管化进程。Wu等将铜掺入到多孔生物玻璃支架里制备得到了可控释放铜的生物支架，发现其能诱导人骨髓间充质干细胞分泌缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor, HIF)-1α和 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，并最终获得了更好血管化[3]。其次，在结构上，支架的孔隙、孔隙率、连通径与血管化密不可分。支架的孔隙和孔间连通径为新生血管提供长入空间，从而使种子细胞获得营养支持并使代谢废物得以清除，Feng等研究发现孔径在400 μm以下时会明显限制新生血管的生长[4]，同时还发现，保持孔间连通径不变，增大孔径只能增加长入血管管径大小，而保持孔径大小不变，增大孔内连通径却能同时增加长入血管的管径和数量[5]。孔隙率是支架另一个重要参数，较高的孔隙率有利于血管化，但同时也会降低支架的力学强度。另外，支架外形也影响其血管化，有研究表明，管状结构的支架比柱状结构的支架血管化效果更好[6]。近年来学者多采用这种管状结构支架或在支架上制备凹槽，结合血管束植入的方法获得更好的血管化[7]。随着三维打印技术的发展，支架内部结构更加精密，外形也更具个性化[8]，并可模拟体内血管通道微观结构预构支架，引导血管更快长入整个支架内部的多孔结构[9]。

2.2 应用具有血管分化潜能的种子细胞

血管内皮细胞(endothelial cells, ECs)、内皮祖细胞(endothelial Progenitor cells, EPCs)和间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是目前常用的具有血管分化潜能的种子细胞。ECs是构成血管壁的基础，且和成骨细胞关系密切，在血管化过程中起着重要作用。EPCs是ECs的前体细胞，已有研究表明其可以在体外培养形成管状结构[10]，将ECs或EPCs与其他具有成骨功能的种子细胞共培养于三维多孔支架材料上是常见的血管化组织工程骨构建方法，细胞间的相互作用可加快血管化，在体外预先形成毛细血管网络，植入体内后能与宿主血管吻合，从而保证了种子细胞的存活[11]。魏等将MSCs和EPCs共培养于支架上，证实在体内、外条件下共培养组均表现出比单一培养组更强的促血管化能力[12]。也有学者将种子细胞培养于体外生物反应器构建组织工程血管获得成功[13]。但由于缺乏真正的细胞外基质，这些共培养的细胞附着性较差，且在支架上分布不均匀，细胞间相互接触与作用较少，难以形成体内细胞所应有的微环境。近来，利用细胞膜片技术构建血管化成为新的热点，Ren等将ECs接种于未分化的MSCs膜片上构建预血管化膜片，并与MSCs分化的细胞膜片复合，植入体内后显示体外构建的血管网能够与宿主血管快速吻合形成新的功能性血管网[14]。

2.3 添加促血管生长因子

很多生长因子具有促进血管新生的能力，如VEGF、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)等，目前认为VEGF是血管形成的关键因子，学者们多采用缓释VEGF的载体与种子细胞复合植于支架中，或利用基因工程技术将表达VEGF的基因片段转染种子细胞，以实现VEGF的缓慢释放。Murphy等采用缓释VEGF的生物支架材料修复大鼠颅骨缺损，发现支架内部形成了比单纯使用支架的对照组更为致密的血管网络[15]。BMP可以促使MSCs向骨或软骨细胞分化，上调成骨细胞中的VEGF并与之协同作用促进血管化[16]。PDGF可以刺激血管周细胞的活动，促进血管的成熟[17]。bFGF可诱导血管内皮细胞迁移到特定部位与平滑肌细胞和成纤维细胞等相结合，直接促进血管生成[18]。但体内血管生成往往是多因子共同作用的结果，学者们常采用多因子联合来获得更好的血管化效果；Li等对比了联合应用VEGF和PDGF因子的支架和单一复合VEGF其血管化速度，发现双因子诱导模式可以使支架更快血管化[17]。Das等联合应用BMP-6和VEGF在修复大鼠下颌骨缺损实验中，也发现了双因子联合应用比单独应用其中一种因子的成骨和成血管化效果更明显[19]。Gothard等提出，联合BMP-2、BMP-7、FGF、PDGF、VEGF 的生物材料是今后研究热点[20]，然而如何经济、实用和操作简单地使用多个生长因子来促进血管化仍有待研究。

3 体内手段

其基本方法是应用外科手段，将组织工程构建物植入体内血管丰富的组织或将血管束植入组织工程构建物中，以诱导其早期快速血管化，根据新生血管形成部位和生长方向的不同可分为外源型的组织包裹法和内源型的血管束植入法，外源型的血管长入及营养方式由外周向中心进行，内源型则相反。

3.1 组织包裹法

将组织工程构建物埋植于富含血管的组织床内，使其被血管或干细胞丰富的组织包裹以促进血管化[21]，其机制主要是创伤、炎症和缺氧等因素激发组织再生途径，诱导局部血管生长因子等表达，促进新生血管由外向内生长。Terheyden等在小型猪背阔肌中预制血管化的组织工程骨，将异位构建的骨瓣转移，成功修复下颌骨缺损[22-23]。Orringer将人骨提取的BMP和自体髂骨混合后植入肩胛下动静脉供血肌瓣中，4 个月游离预制骨瓣修复其大范围颌骨缺损[24]。Warnke等将加入自体骨髓干细胞和重组人骨形成蛋白-7(rhBMP-7)的BioOss块状骨植入患者背阔肌内构建组织工程骨，7周后带血管蒂转移成功修复一口底癌患者大段下颌骨骨缺损[25]。Zhou等通过脱钙同种异体骨、珊瑚羟基磷灰石复合rhBMP-2，外包个性化钛网塑形，然后植入恒河猴背阔肌中异位预制个性化、血管化组织工程骨，13周后将其带蒂移植，修复恒河猴下颌骨节段性缺损，观察到预制组修复的下颌骨缺损，其成骨较原位植入rhBMP-2的对照组更好，骨连续性、体积和外形更佳[26]。这种通过预制后的组织工程骨能提早建立稳定的血供，可增加肌骨瓣的抗感染能力，并可带软组织修复颌骨复合缺损，较原位植入的优势大大增加。

3.2 血管束植入法

是指通过植入血管束(vascular bundle,VB)或构建动静脉环(arteriovenous loop,AVL)的方法在支架内部预构内循环网络[27]。VB是将体内相邻的两条动静脉血管束直接穿过支架材料中间，而后血管束长出大量毛细血管侧支，从而形成丰富的血管网。研究证实VB植入的支架比无VB植入组血管化更好[7]。杨等将植入兔体内的VB远端结扎，和血流通畅的VB未结扎组对比，发现两组均能有效促进组织工程骨血管化，但未结扎组的促血管作用比结扎组更好，说明VB十分具有临床应用价值，即使植入支架内的血管发生栓塞也能发挥很好的促血管作用[28]。AVL则是将体内相邻的两条动静脉近心端用显微外科方法进行端-端吻合术，形成动静脉短路环包绕支架。该方法最早由2006年Kneser等人首次运用于骨组织工程，他们在植入大鼠体内的小牛骨支架中构建AVL，经组织学、血管造影、MRI和血管灌注等方法检测均发现大量的新生血管[29]。后来国内学者Dong等人运用同样的方法在新西兰兔股动静脉构建AVL，嵌入天然滨珊瑚块中，外包聚四氟乙烯膜隔离，植入后发现支架材料表面及中心部位均形成了致密的血管网络，且血管网密度也显著高于单纯植入支架材料的对照组[30]，进一步研究表明，AVL诱导血管新生的能力比VB更强，原因在于两者促血管新生的机制不同，AVL动静脉相互吻合，血流动力学的改变促使大量毛细血管芽生并相互交联形成丰富的血管网，而VB不存在此形式，血管生成效率偏低[31]。但从临床应用方面来看，AVL因手术操作复杂和成功率较低等缺点，仍需进一步研究改进。

3.3 展望

颌骨组织工程血管化研究取得了很多进展，但仍存在明显的不足，如多孔型支架材料虽然能促进血管长入，但同时也削弱其力学性能；种子细胞的优选、多向分化和与支架的有效结合；促血管生长因子的效果确定，但其剂量控制和缓释技术仍不足；构建动静脉环或植入血管束会增加手术时间和创伤。血管化是多因素共同作用的复杂生理过程，多策略联合应用仍将是未来颌骨组织工程血管化的重要方向。