漆酶可降解底物种类的研究进展

张泽雄 刘红艳 邢贺 马钰

（桂林理工大学化学与生物工程学院，桂林 541004）

漆酶可降解底物种类的研究进展

张泽雄 刘红艳 邢贺 马钰

（桂林理工大学化学与生物工程学院，桂林 541004）

漆酶是一种含铜离子的多酚氧化酶，广泛存在于植物及真菌中。漆酶含特有的铜离子，其功能为传递结构中的电子，使漆酶具有了较强的氧化还原能力，能与木质素、胺类化合物、芳香化合物等底物发生作用，且大多数反应的唯一产物为水。目前，漆酶在降解多种有毒物质和有害污染物方面表现出高效、成本较低的特性，如白腐真菌所产的高水平漆酶已广泛成熟应用在工业废水处理等生物整治和修复领域。近年来最新研究利用载体固定化酶的技术使漆酶能够在使用后回收反复利用且更具有稳定性，这降低成本的同时还保持了漆酶催化氧化的特性，克服了不少漆酶在解决环境污染中出现的问题。利用介体的介导作用解决了漆酶氧化还原电势较低的问题，大量增多了可降解底物的种类，使其在废水处理、污染物降解、土壤修复、工业染料漂白等领域的应用前景更广阔。对现有漆酶应用于各领域进行研究总结，综述了降解各领域中的有害污染物等底物种类，提出了利用漆酶的降解过程中的现有不足和改进方向，以期为生物法降解环境污染物的研究提供参考。

漆酶；底物；环境污染物

1 漆酶的简介

1.1 漆酶的来源

漆酶最早发现于漆树，漆树漆酶也是目前在植物源中获取活性最高的漆酶，除此以外，在其他植物中也能提取出漆酶［6］。在昆虫等动物中也发现了漆酶，但是这类漆酶可能为仅具有类似漆酶催化功能的多酚氧化酶［7］。微生物漆酶的研究主要以真菌漆酶为主，目前产漆酶的真菌已超过上千种，其中担子菌（Basidiomycetes）和子囊菌（Ascomycetes）就 有近百 种［8］。在 1993年，Givaudanet等［9］首先报道了从根际细菌生脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferun）中发现了漆酶，对比真菌漆酶，细菌漆酶的分子组成较为单一，没有糖基化的修饰，目前对细菌漆酶的研究和应用较少。漆酶同工酶［10］作为漆酶的另一种补充来源，成为研究的又一热点，目前已经提出了白漆酶和黄漆酶两种同工酶［11］。

1.2 漆酶的结构及催化机理

漆酶是一种糖蛋白，大多数为单体酶，单体的相对分子质量达5×104-5×105，该糖蛋白由铜离子、肽链和糖配基3部分组成。漆酶分子结构中一般含有4个铜离子3个结合位点，铜离子是构成漆酶活性中心的关键，在催化底物反应中起着电子转移的作用［12］，根据磁学与光谱学性质可分为3类：一个Ⅰ型 Cu2+（T1Cu）和一个Ⅱ型 Cu2+（T2Cu），这两种为单电子受体，呈顺磁性；两个Ⅲ型Cu2+（T3Cu），为耦合离子对，双电子受体，呈反磁性［13］。糖配基含有氨基己糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等，糖配基中的这几种成分含量的不同造成了漆酶分子量的巨大差异。共价连接的碳水化合物部分的含量占10%-40%，是提高酶稳定性的原因［14］。

漆酶的催化机理较复杂，其作用于不同底物时的反应机理不全相同，但可以总结归纳出一点：漆酶通过电子转移氧化底物，使底物生成不稳定的中间体后再反应，且在催化大多数富含电子底物的单电子氧化过程中可同时将氧分子还原成水［15］。

2 漆酶降解底物的种类

漆酶作为一种氧化酶，具有特殊的催化性能，可氧化木质素、酚类化合物、非酚类化合物等底物，且随着漆酶的氧化还原电势越高，可降解的底物范围越广［16］，应用领域也就越大。利用介体以及将漆酶固定到载体上使用是目前研究热点，保持其活性和专一性的同时还克服了游离漆酶的不足，使固定化后的酶稳定性好，还可分离回收利用，操作可控。

2.1 木质素

木质素是由醇单体及其衍生物结构单元形成的芳香性高聚物。韩美玲等［17］发现在白腐真菌产漆酶的培养基中加入棉籽壳作为木质纤维素诱导物后，有效地提高了其分泌的漆酶活性。但同时木质素结构极其复杂并难以降解，是现在生物工业上一大挑战。目前漆酶在木质素降解中起重要作用，早期有研究表明漆酶能够直接催化使低分子量的木质素模型中的化合键断裂［18］，但也有研究认为漆酶需要介体系统才能催化木质素底物中键的断裂［16］，近年Majumdar等［19］发现漆酶能够在没有介质的情况下降解酚类木质素模型化合物，但是对非酚类的木质素则必须利用介质才能降解。黄麻纤维是加工麻袋等产品的优质原料，但其中高达16%的木质素导致黄麻纤维粗硬，可纺性差，经漆酶-介体体系处理后，得到的黄麻纤维木质素分子量和羟基含量比只用漆酶直接降解的更低［20］。

2.2 染料

纺织、纸张、皮革等工业合成染料种类繁多，这类废水会影响水生生物及微生物的生长，还会危害人类健康。染料按结构大致可分为4类：偶氮染料、靛蓝染料、蒽醌染料和三苯甲烷类染料，这些染料都具有较大的生物毒性，大多还是“三致”物质。

偶氮染料是目前各染料领域使用最广泛的染料，由偶氮基连接芳基而成。李飞等［21］诱导杏鲍菇漆酶降解龙胆紫与酸性铬兰K的脱色率达63.8%与76.9%。而对弱酸性偶氮染料的降解效果更明显，其中酸性黑231与酸性黑210的降解效率分别高达96.4% 和 92.2%［22］。司静等［23］以微酸多年卧孔菌所产的漆酶对多种染料进行脱色时，偶氮染料刚果红的脱色率达91.57%，且发现是否加入2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐［2，2’-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS］对脱色效果无明显差异。在利用固定化技术方面，以海藻酸钠为载体，交联剂使用戊二醇降解偶氮染料，由于戊二醇同时也是酶的变性剂，使酶在固定化过程中损失活力而降低固定化率，而海藻酸钠有着较大的孔状结构，易漏出大分子酶，故用以包埋结合交联的方式固定化酶能取得更好的效果［24］。经过固定化后测得对刚果红的脱色率还能维持在50%左右，这也使固定化酶在印染处理领域仍然有良好的应用前景。

靛蓝染料是牛仔裤的主要染料，其以碳碳双键带羰基的杂环共轭体系为母体，结构稳定，而漆酶氧化还原电势较低，因此需借助电子传递介质分解靛蓝［25］，以 1-羟基苯并三唑（1-Hydroxybenzotriazole，HBT）为诱导剂，漆酶降解靛蓝染料的脱色率达96.5%。高恩丽等［26］发现在生物治理过程中，漆酶会与酸性纤维素酶产生协同作用，使废水中靛蓝浓度降低83.8%。

蒽醌染料含有两个以上的羰基，由蒽醌和稠环酮结构组成，漆酶需利用介体物质介导对其氧化完全脱色［27］，实质上也是酶与底物的间接氧化。任大军等［28］以漆酶结合ABTS的介体系统，该系统对蒽的降解率达到90%以上。有研究认为漆酶能对个别蒽醌染料直接降解，马利［29］发现在不加介体条件下漆酶对活性蓝4与雷玛唑亮蓝仍能达到不错的脱色效果。

三苯甲烷染料分子是由中心碳原子连接着3个芳环，其使用量在染料中仅次于偶氮类染料。司静等［30］对栓孔菌属筛选出了漆酶的高产菌株东方栓孔菌（Trametes orientails），并利用其发酵所得的粗酶液对三苯甲烷类结晶紫进行脱色，效果明显且脱色率高达90.36%［31］。漆酶对常用的三苯甲烷类染料溴酚蓝溶液的脱色率也能达到94.5%［32］，其他三苯甲烷类染料如酸性品红、副品红、甲基绿等都具有毒性，但都已被证明可由云芝菌所产的漆酶降解［33］。还有报道测试了芽孢杆菌菌株所产的漆酶能脱色三苯甲烷类的染料［34］，他们发现相比真菌漆酶，这种细菌漆酶更耐高温且有稳定的pH［35］。

2.3 氯酚类化合物

氯酚类化合物具有较高的毒性，且化学性质稳定不易被分解，在自然环境下降解的非常缓慢。漆酶降解氯酚类污染物的研究在国内外都取得了不错的效果，利用蜜环菌发酵的漆酶粗酶液就可以直接催化降解2，4-二氯酚和2-氯酚［36］，反应10 h后降解率最高分别可达97%和93%。Gaitan 等［37］在漆酶粗酶液中分离出两种分子量分别为60和120 kD的漆酶同工酶，对含有多种氯酚的混合物进行降解8 h后发现，其中五氯酚降解率仅有40%，而其余氯酚则几乎完全降解。固定化酶的技术在降解氯酚类取得丰富的进展：贺芙蓉等［38］利用磁性二氧化硅表面接枝的聚丙烯酰胺络合Cu2+离子，制备表面铜螯合磁性SiO2材料，这种金属螯合配体与蛋白质表面供电子氨基酸间的相互作用固定化漆酶，有效降解了2，4-二氯酚，且加入SO4-离子后可明显促进降解效果；李永涛等［39］发现堆肥固定化漆酶降解土壤中五氯酚的效果优于壳聚糖固定化漆酶，原因在于堆肥能提高土壤中微生物的数量与活性而提高了漆酶酶活；电化学降解法通过有催化活性的电极反应产生OH-从而降解大多数有机污染物，李丽芳等［40］利用电化学-固定化漆酶联合工艺催化降解水中的五氯酚，这种电化学的联合工艺相比单独固定化漆酶对五氯酚的降解率提高了38.5%。

2.4 多环芳烃类

多环芳香烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs），是由两个以上的苯环稠合而成的持久性有机污染物，煤、石油、天然气等燃料的大量燃烧及石油的泄露导致环境中多环芳烃的剧增对人类的健康造成威胁。

早在1993年，Davis等［41］研究发现了所有的真菌都具有先天降解多环芳烃的能力。Majcherczyk等［42］以云芝菌所产漆酶对14种多环芳烃降解进行测试发现，其中包括苊、荧蒽、芘及苯并［a］蒽等的降解率仅约10%，但在加入HBT后明显提高了漆酶对这些多环芳烃的降解效率，芘、苯并［a］蒽的降解效率达50%，苊、苊烯、芴、蒽等几乎完全被降解。一种基于戊二醛和氨基修饰的SBA-15载体共价固定方法已成功应用于固定漆酶［43］，并有效降解萘、菲、蒽且活性接近于未固定化的自由漆酶，表明介孔载体的引入不会对催化过程造成明显的抑制。

国内学者近年来也研究了漆酶降解多环芳烃，李烜桢等［44］考察了两种食用菌平菇（Pleurotus ostreatus）和鸡腿菇（Coprinus comaus）所产的漆酶对15中多环芳烃的降解能力，结果表明培养平菇食用菌所得的粗酶液对多环芳烃的降解效果优于鸡腿菇，原因推测可能由于平菇分泌了更多的调节物质而提高了降解率。非离子表面活性剂改性黏土是一种除去土壤中有机化合物的高效吸附材料，通过利用非离子表面活性剂改性黏土固定真菌漆酶后，能更有效地降解多环芳烃［45］。

2.5 内分泌干扰物

内分泌干扰物也称环境激素，其中多种有机污染物如烷基酚、双酚A、邻苯二甲酸盐、多氯联苯等并不是直接使生物体中毒，而是类似激素影响人和动物体内正常的激素功能，造成内分泌失衡，严重的威胁人类和野生动物的物种繁衍和长期生存。

酞酸酯类作为一种人工合成的塑料增塑剂，也是现在难降解的有机污染物的一种。烷基酚是一类由酚烷基化后产生的化合物，壬基酚和辛基酚是其中典型的有害物质，这类长链烷基酚广泛应用于活性剂、洗涤剂中，也是现工业原料和中间体。近年来，国内外不断有人研究生物技术降解酞酸酯类污染物。Macellaro等［46］研究漆酶对双酚A、壬基酚、对烃基苯甲酸甲酯、对烃基苯甲酸丁酯及邻苯二甲酸二甲酯的降解中发现，只有双酚A可以不利用介质直接被漆酶降解，而对其他4种直接降解几乎无效。Catapane等［47］研究漆酶的固定化发现，壬基酚比辛基酚在固定化方面有更高的亲和力，但对同浓度的两种底物降解时，完全除去辛基酚的时间明显快于除去壬基酚。李飞等［48］以海藻酸钠为载体，用双孢菇漆酶凝胶包埋固定化的工艺对邻苯二甲酸二甲酯的降解率达40%。还发现在酶用量超过1 g后，增大酶的用量反而影响降解效果，推测是酶用量的增大导致体系变得拥挤，使凝胶小球无法充分与底物结合。

双酚A是现在普遍使用的化工原料，广泛用于塑料、橡胶和涂料等，过去在婴儿奶瓶中检测到双酚A引起了高度重视。生物降解法是一种有效安全降解双酚A的方法，国内外很早就对漆酶降解双酚A有了成熟的研究。Catherine等［49］发现漆酶降解双酚A后的产物大多数都是2-6个重复单元无毒的低聚物。目前通过各种固定化的方法固定漆酶降解双酚A的研究也取得了成功，这些固定化的原理都是通过物理或化学的方法处理酶使之不溶于水且能反复连续使用仍具有活性。例如，将TiO2纳米粒子通过低温溶胶-凝胶过程涂布在膜表面，然后通过化学偶合将漆酶固定在膜上［50］；采用乳液静电纺丝技术原位固定酶，使载酶电纺纤维呈壳-核结构保护漆酶［51］；利用氧化石墨烯巨大的比表面积，以磁性石墨烯为载体固定化漆酶［52］等。

多氯联苯属于致癌物，化学性质稳定，难以在自然界中分解。Keum［53］取白腐真菌云芝栓孔菌和平菇产漆酶对烃基多氯联苯进行降解测试，发现这两种白腐菌漆酶具有降解烃基多氯联苯的能力，且云芝栓孔菌漆酶降解速度快于平菇漆酶。高国瑞［54］试验青霉菌降解多氯联苯，在降解过程中发现，一定范围内漆酶活性与降解率趋势相同，说明在青霉菌降解多氯联苯中漆酶起了重要作用。

3 展望

微生物法廉价、安全、不会造成二次污染，利用微生物法降解环境有害污染物是当前的研究热点。而漆酶底物种类的繁多更使人们聚焦于此，早期漆酶作用的底物就多达250余种，但也存在许多尚未解决的问题，如漆酶的稳定性不足、氧化还原电势低等，真正成熟应用降解的底物屈指可数。得益于对介体的探究，让我们对漆酶应用于底物的机理有了全新的认识，加入介体和固定化酶的方法使漆酶降解能力大大提升，扩大了底物范围。但许多研究发现固定化后漆酶的活性难以保持游离漆酶的酶活，如何保证扩大底物的作用范围同时还能保持酶的活性是现需要解决的一重大问题。此外，漆酶的来源广泛，但现研究应用都集中于真菌漆酶，来源不同其结构功能也会有所差异，是否能在其他来源上得到成熟以及更广泛的应用也是值得深入研究的方向。漆酶在生物降解污染物中的潜力很大，若能解决上述问题将会有更广阔的应用前景。

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Research Progress on Substrate Species Degraded by Laccase

ZHANG Ze-xiong LIU Hong-yan XING He MA Yu
（College of Chemistry and Bioengineering，Guilin University of Technology，Guilin 541004）

Laccase，a polyphenol oxidase that binds multiple copper ions，is widely found in plants and fungi. Laccase contains unique copper ions which function is to transfer electrons in the structure，so that the laccase has a strong redox capacity，and the only product of the most reactions with lignin，amine compounds，aromatic compounds such as the role of the substrate is water. It has the characteristics of high efficiency and low cost in the degradation of many toxic substances and harmful pollutants，such as white rot fungi produced by the high level of laccase has been widely used in industrial wastewater treatment and other biological remediation and repair areas. In recent years，the lastest research showed that the using of vector immobilized enzyme technology allows laccase to be recycled after use and reused and more stable，which reduces costs while maintains the characteristics of laccase catalytic oxidation，it has overcome the problems of laccases in solving environmental pollution，Under the mediating effect of mediator，the problem of low potential of laccase redox has been figured out，and it greatly increased more kinds of substrate. Therefore，the application prospects in wastewater，degradation，soil remediation，industrial bleaching and other fields will be much broader. This paper summarily describes the applications of laccase in various fields and the types of harmful pollutions substrates，put forward the deficiency and the improving direction of existing degradation process of laccase aiming at providing the reference for the study of biodegradation of environmental pollutants.

laccase；substrate；environmental pollutant

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0417

早在1883年，日本科学家田彦六郎［1］发现紫胶漆树树液中的酶能使“树漆”氧化而变的坚固，直到1894年法国人Bertrand［2］详细地研究了东南亚漆树中的酶，并命名为漆酶（Laccases）。漆酶（EC1.10.3.2）是一种结合多个铜原子的蓝色多酚氧化酶，分布于植物、微生物、高等真菌和少数细菌中，与哺乳动物血浆铜蓝蛋白及植物抗坏血酸铜蓝蛋白一样，都属于铜蓝蛋白家族［3］。漆酶可稳定存在于空气中，且许多反应的唯一产物为水，因而被归为环保型酵素。担子菌门的白腐真菌生产的漆酶效果最好［4］，此类高水平的漆酶也成为了研究重点，且固定化后使漆酶更稳定地反复使用，利用小分子介体更是提高了漆酶反应效率，还大量增加了可降解底物的种类［5］。近年来随着环境污染问题愈发严重，国内外对漆酶降解污染物的研究也愈加重视，本文就近年来对漆酶降解污染物底物的研究现状作一综述，以期通过生物法更高效地降解环境污染物。

2017-05-22

国家自然科学基金项目（21467006）

张泽雄，男，硕士研究生，研究方向：环境微生物化学；E-mail：2542979281@qq.com

刘红艳，女，副教授，研究方向：生物化学与环境污染物化学；E-mail：lhyglite@126.com

（责任编辑 狄艳红）