一种适于本科实验教学的双向电泳技术体系

赵玉红, 李 欣, 崔建林, 周 浩, 李登文,李小菊, 张金红, 赵立青

(南开大学 a. 生物实验教学中心; b. 医学院， 天津 300071)

一种适于本科实验教学的双向电泳技术体系

赵玉红a, 李 欣a, 崔建林b, 周 浩a, 李登文a,李小菊a, 张金红a, 赵立青a

(南开大学 a. 生物实验教学中心; b. 医学院， 天津 300071)

双向电泳技术是当前蛋白质组学研究中的重要技术。设计“双向电泳检测热休克处理对细菌蛋白表达谱的影响”的实验，以PGEX-4T-2大肠杆菌中可溶性总蛋白为研究对象, 采用双向电泳技术筛选热休克处理后有差异表达的蛋白。实验获得了稳定性较高、分辨率和重复性较好的电泳图谱，建立了一种适于本科实验教学的双向电泳技术体系。通过该实验，学生可以掌握双向电泳技术的基本原理、实验方法以及蛋白提取的一般思路与方法。

双向电泳； 实验教学； 热休克； 细菌蛋白表达谱

0 引 言

20世纪90年代中期，蛋白质组学作为功能基因组学的重要支柱应运而生[1]，特别在医药学领域，蛋白质组学是寻找人类疾病新的生物标志物和发现药物治疗新靶点的一种主要工具[2]。双向电泳(Two-Dimensional Electrophoresis, 2-DE)作为蛋白质组学的核心技术之一，是目前唯一一种可以将数千种蛋白质同时分离的方法，可用于研究样品中总蛋白、不同样品蛋白质表达差异、蛋白质间相互作用、以及蛋白修饰等[3]。在目前发表的与蛋白组学研究相关的论文中, 有80% 以上的论文中涉及双向电泳技术[4]，因此，有必要在本科实验教学中引入该项技术。

常规双向电泳存在电泳时间长、系统产热多、微量的蛋白质样品极易扩散、不利于实验结果的观察等弊端。因此,建立实验检出的灵敏度高、电泳时间短、适合学生操作的双向电泳条件非常必要[5]。

结合现代生物科学发展的需要，根据本科生实验教学特点，设计“双向电泳检测热休克处理对细菌蛋白表达谱的影响”的实验，建立了一种适于本科实验教学的双向电泳技术体系。以PGEX-4T-2大肠杆菌总蛋白为研究对象,以37 ℃培养的大肠杆菌作为对照组，42 ℃热休克处理的大肠杆菌作为实验组，选择7 cm、pH 3～10 IPG胶条，采用丙酮沉淀大肠杆菌中的总蛋白，上样量为175 μg，进行双向电泳。经电泳结果图像扫描、PDQuest分析软件分析，筛选差异表达蛋白。

1 主要实验仪器

超声破碎仪,酶标仪,Bio Rad双向电泳系统(包括等点聚焦仪、GS-800光密度仪以及PDQuest分析软件等),垂直板电泳设备(电源、电泳槽、制胶架等),高速冷冻离心机,摇床等。

2 实验材料与试剂

(1) 实验材料：大肠杆菌(E.coli，pGEX-4T-2)。

(2) 试剂：pH 3～10两性电解质载体购自Bio Rad，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Solarbio，AP，TEMED，SDS，甘油，Tris，溴酚蓝，甘氨酸购自sigma，尿素，CHAPS，DTT，碘乙酰胺，低熔点琼脂糖等购自楠梓商贸有限公司，MilliQ水，其余试剂为国内分析纯。

(3) 耗材：7cm，pH 3～10 IPG预制胶条购自GE、96孔酶标板。

3 实验方法

3.1 大肠杆菌中可溶性总蛋白的提取与定量

(1) 热休克处理：将活化的大肠杆菌接种至2瓶250 mL LB(Amp)培养基中，37 ℃培养过夜，2瓶细菌分别继续培养37 ℃ 40 min、42 ℃ 40 min；

(2) 菌体蛋白提取及含量检测：4 ℃，8 000 r/min离心5 min收集菌体，以预冷的50 mM pH 8.0 Tris-HCl重悬菌体至20 mL；低温下超声波裂解菌体，至悬浮液清亮(200 W，破5 s，停6 s，26个循环)；4 ℃，12 000 r离心20 min，收集含可溶性蛋白的上清，分装入2 mL离心管中，每管0.5 mL；加入3倍体积-20 ℃预冷丙酮(0.5 mL菌体+1.5 mL丙酮)，-20 ℃沉淀蛋白2 h(沉淀等体积的两管蛋白，其中一管用于测定蛋白质浓度)；12 000 r/min，4℃，30 min收集蛋白，弃上清。冷丙酮洗沉淀2次，-20 ℃保存备用。按照试剂盒使用说明书，测定样品蛋白含量。

3.2 双向电泳

(1) 第一向等电聚焦电泳(IEF)。蛋白沉淀溶于水化上样缓冲液(8 M尿素、4 % CHAPS、65 mM DTT、0.2 % Bio-Lyte、0.001 %溴酚蓝)，终浓度为1.4 mg/ml，上样量175 μg。胶条加1.5 mL矿物油覆盖。设置等电聚焦程序：18 ℃被动水化12 h；250 V(线性)30 min；500 V(快速)30 min；4 000 V(线性)3 h；4 000 V(快速)20 000 h；500 V(快速)，任意时间。

(2) 胶条平衡。聚焦好的胶条先后加入2.5 mL平衡缓冲液I(6 M尿素、0.2 % SDS、0.375 M pH 8.8 Tris-HCl、20 %甘油、2 % DTT)和2.5 mL平衡缓冲液II(6 M尿素、0.2 % SDS、0.375 M pH 8.8 Tris-HCl、20 %甘油、2.5 % DTT)，分别平衡15 min。平衡后的胶条浸没在1×TAE电泳缓冲液中。

(3) 第二向SDS-PAGE电泳。配制12 %的分离胶，胶厚1 mm。将平衡好的胶条转移至SDS—PAGE胶，用0.5 %低熔点琼脂糖封胶液(0.5 %低熔点琼脂糖、25 mM Tris、 192 mM甘氨酸、0.1% SDS、 0.001 %溴酚蓝)封闭。将凝胶转移至电泳槽中，加入电泳缓冲液(25 mM Tris，200 mM Gly，0.1 % SDS)，接通电源，初始设置低电流(5mA/gel/17cm)或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，加大电流(或电压)(20～30 mA/gel/17cm)，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时停止电泳。电泳结束后，取出凝胶，切角以标记正负极；0.25%考马斯亮兰R250染液(考马斯亮蓝R250 2.5 g，无水乙醇250 mL，冰乙酸80 mL，水670 mL)室温染色20 min；用水漂洗凝胶，微波炉水煮15 min，2～3次。加入脱色液(7.5 %冰乙酸，5%甲醇)脱色过夜，至获得清晰蛋白点。

3.3 电泳结果扫描、PDQuest8.0 软件分析电泳结果

电泳结束后，用GS-800图像扫描仪对凝胶进行扫描，扫描方式为透射。PDQuest8.0分析软件进行图谱分析。

4 结果与讨论

4.1 实验结果

采用超声破碎法进行细胞破壁，利用丙酮沉淀大肠杆菌中总蛋白，选择7 cm、 pH 3-10 IPG预制胶条，上样量为175 μg，进行双向电泳，结果如图1、2所示。从图1、2中可以看出，通过该双向电泳体系能够获得稳定性较高、分辨率和重复性较好的电泳图谱。经PDQuest8.0分析软件初步分析，37℃培养的大肠杆菌对照组和42℃热休克处理的大肠杆菌实验组分别检测到500多个清晰的蛋白点，未筛选出有明显表达差异的蛋白点。

4.2 注意事项

(1) 超声破碎过程中会产生大量的热，因此整个过程必须冰上操作且间歇处理；

(2) 本实验采用BCA法对蛋白进行定量。蛋白用丙酮沉淀吹干后，往往难以完全溶解在PBS中，定量前离心处理会有效降低实验误差；

图1 对照组(37℃培养的大肠杆菌)总蛋白双向电泳图谱

图2 实验组(42℃热休克处理的大肠杆菌)总蛋白双向电泳图谱

(3)蛋白样品易溶于水化上样缓冲液，但为防止少量未溶蛋白对等点聚焦及SDS-PAGE电泳的影响，离心后再上样；加样时注意不要产生气泡，否则影响到胶条中蛋白质的分布。

(4) 两性电解质载体所形成的pH梯度的稳定性对电泳结果的稳定性和可重复性有非常重要的影响[6]，本实验所使用的两性电解质载体购自Bio Rad，效果优于国产试剂；

(5) 灌制SDS-PAGE胶时，胶面一定要平，否则第一向的胶条不能很好的和胶面接触，影响电泳效果[7]。经验做法：TEMED量不要太多，以30min左右能凝最好；灌胶以水封胶面后，稍微水平摇晃一下，置于水平桌面待其自然凝固。

4.3 讨论

(1) 课程组织。本实验适于以综合实验的形式开设，进度宜安排24学时，小班授课。第一天进行蛋白样品的制备与定量以及第一向等点聚焦电泳；第二天配制分离胶，进行第二向电泳，染色、脱色；第三天电泳结果扫描及图像分析。实验以单人操作的形式为主，每人一根胶条。按照人数，将学生划分为对照组和实验组，组间的结果作为平行实验结果参考。

(2) 染色。不同的凝胶染色方法对双向电泳成像效果以及蛋白质点的检测有很大影响[8]。实验室常用的染色方法主要有考马斯亮蓝染色和银染。考马斯亮蓝染色灵敏度虽然远低于银染，但考马斯亮蓝染色过程简单, 操作简便，染色后的背景及对比度好[9-11]。故本实验采用考马斯亮蓝R-250染色，结果表明获得的可辨别的蛋白点也很多，可以满足一般的实验教学。

(3) 图像分析。图像分析是2-DE中十分重要的一步，其作用是评价和量化电泳结果。只有较为精确地对蛋白点进行识别、对比、定量,才可能有效地分析各组凝胶上的蛋白数据,从而得到有意义的生物学信息[12]。为了使学生更好地掌握分析软件的使用，通常以Bio Rad厂家提供的2-DE图谱作为范例讲解，包括图像优化、点检测、点匹配、手动校正、结果报告等，然后由学生对自己的实验结果做出分析。通常选取对照组和实验组中蛋白点最清晰、横竖纹及拖尾相对少的图谱进行分析和比较。

5 结 语

本文建立了一种适于本科实验教学的双向电泳技术体系，优点如下：① 蛋白样品取材方便。本实验选取的材料是大肠杆菌，很容易获得且生长速度快，易于根据实验目的扩大培养。② 制备方法简单有效。在双向电泳技术中,样品制备是整个分离过程中的关键一步,对实验结果将起到决定性作用，如果样品制备过程出现问题将直接影响2-DE的结果与分析[13-16]。对于不同的实验材料、实验室条件以及实验目的，采用不同的样品处理方法。本实验的研究对象是大肠杆菌中的全部水溶性蛋白，菌体超声破碎离心后，上清直接用丙酮沉淀，实验方法简单，蛋白丢失相对较少。③ 可获得稳定性较高、分辨率和重复性较好的2-DE图谱。双向电泳实验中很多因素都可能影响到最终的实验结果，本实验一方面对学生的动手操作提出了很高的要求，另一方面需要学生综合运用所学知识来分析解释复杂的实验结果，有助于提高学生的实验技能和综合素质。④ 利用简单的热休克处理手段，加深学生理解双向电泳技术在蛋白质组学研究中的应用。

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Establishment of a Convenient Two-Dimensional Electrophoresis Technique in Undergraduate Experimental Teaching

ZHAOYu-honga,LIXina,CUIJian-linb,ZHOUHaoa,LIDeng-wena,LIXiao-jua,ZHANGJin-honga，ZHAOLi-qinga

(a. Biological Experimental Center; b. College of Medicine， Nankai University， Tianjin 300071， China)

Two-dimensional electrophoresis (2-DE) is an important technology in proteomics research. The experiment of the effect of heat shock treatment on the expression profile of bacterial protein was designed to provide undergraduate an experiment for 2-DE technique. The soluble proteins from Escherichia coli was studied by 2-DE. The higher stability and resolution repeatability 2-DE maps were obtained. Through this experiment, students can master the basic principle, experiment method of 2-DE and the general idea of protein extraction.

two-dimensional electrophoresis； experimental teaching； heat shock； expression profile of bacterial protein

2016-01-28

国家基础学科人才培养基金“条件建设项目”(J1310003)；南开大学2014年教学改革项目

赵玉红(1981-)，女，山东青岛人，硕士，实验师，从事生物化学和分子生物学实验教学工作。

Tel.：13920242524; E-mail:zyh@mail.nankai.edu.cn

赵立青(1962-)，女，云南洱源人，博士，教授，从事蛋白质结构与功能研究以及基于蛋白质结构的工程应用。

E-mail：lqzhao@nankai.edu.cn

G 642.0； Q 503

A

1006-7167(2017)01-0177-03