乳酸链球菌素—普鲁兰多糖—海藻酸钠可食用抗菌共混膜的制备及其在生鲜肉保鲜中的应用

摘 要：研究乳酸链球菌素（nisin）-普鲁兰多糖（pullulan，PUL）-海藻酸钠（sodium alginate，SA）可食用抗菌共混膜的工艺条件，通过调整物料比，制备一种具有良好性能和抗菌能力的可食用膜，并测定膜的透光度、水蒸气透过率、傅里叶转换红外线光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）、扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）和肉的菌落总数、pH值、色差等指标，研究物料比对共混膜性能的影响和共混膜对生鲜肉的抑菌性能。结果表明：PUL和SA之间存在氢键相互作用促进了两相的相容，最佳的可食用共混膜投料比为PUL∶SA=1∶2（V/V）、乳酸链球菌素2 g/L。此物料比的共混膜透光度为89.03%，溶解度为31.31%，对色差没有显著影响，对生鲜肉的贮藏保鲜效果较好，可以有效延长生鲜肉货架期至16 d。

关键词：可食用膜；普鲁兰多糖；抗菌性；多元共混

Abstract： In this paper， we developed a composite edible film consisting of nisin， pullulan （PUL） and sodium alginate （SA） with good performance and antimicrobial activity by adjusting the proportions of these ingredients. The light transmittance， water vapor permeability， Fourier transform infrared （FTIR） spectra and scanning electron microscopic （SEM） images of films and the total plate count， pH and color difference of pork meat were measured as a function of the proportions of the ingredients and the antimicrobial activity of composite edible films was assessed in fresh pork. The results showed that hydrogen bond interactions between PUL and SA favored their mutual dissolution. A PUL-to- SA ratio of 1：2 （V/V） and a nisin concentration of 2 g/L were found to be optimal， giving a light transmittance of 89.03% and a water solubility of 31.31%. This optimized formulation provided good preservation of pork quality without effect on color difference during chilled storage， extending the shelf life to 16 days.

Key words： edible film； pullulan； antibacterial； multiple blending

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201704004

中圖分类号：TS206.4 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2017）04-0017-06

引文格式：

贾晓云， 张顺亮， 刘文营， 等. 乳酸链球菌素-普鲁兰多糖-海藻酸钠可食用抗菌共混膜的制备及其在生鲜肉保鲜中的应用[J]. 肉类研究， 2017， 31（4）： 17-22. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201704004. http：//www.rlyj.pub

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可食用膜以天然高分子材料为基料，以分子间或分子内作用力成膜，通过浸渍、喷涂和涂渍等方式把具有可食性的材料覆盖于食品表面，从而实现在食品贮存、流通、销售等环节保持食品良好的物理状态和食用口感的目的[1-5]。

可食用膜不仅可以保护食品，还可以通过调整物料种类和添加抗氧化剂、抗菌剂等方式改善材料的功能性从而提高食品的货架期等品质，减少食品在贮藏和流通环节的损耗[6-8]。可食用膜最为重要的指标为膜材料对外环境中氧气、水分的阻隔性能。可食用膜既无环境污染，又具有对外环境的物理阻隔作用，有效减少食品水分流失和降低化学反应速率、避免微生物与食物接触。所以，可食用膜对生鲜肉货架期的延长有较大的意义[9-10]。近年来越来越多的研究集中在含有添加特殊组分（例如抗菌剂、抗氧化剂等）的功能性可食用膜的制备[11-13]。Song Yongling等[14]以海藻酸钠为成膜剂，将抗氧化剂茶多酚添加在可食用膜中，发现该配方可以延缓鱼肉的变质，改善感官品质从而延长鲂鱼的货架期。Ojagh等[15]将肉桂精油和壳聚糖复合膜用于改善鲑鱼的食品品质及感官性能，研究发现这种复合膜可以抑制鱼肉的脂肪氧化，并改善色泽。以天然高分子聚合物作为可食用的包装材料，由于单一的聚合物性能具有局限性，可以采用共混的方式将不同聚合物的优点集合，使可食用的包装材料达到更为优良的性能。

普鲁兰多糖是由α-（1，6）糖苷键连接而成的线性高分子多糖[16-17]，其水溶液有较好的成膜性，且薄膜热稳定性能好，热封性能良好，安全环保[15]。纯普鲁兰多糖力学性能不佳，脆性大且硬，且价格偏高。将纯普鲁兰多糖与其他的高分子材料进行多元共混，不仅可以改善性能，增加其柔韧性，还可以降低成本，更适于食品包装的生产使用。海藻酸钠来源于褐藻类植物，无毒性、亲水性强、价格低廉[19]。由于凝胶性和成膜性质良好，较多的研究集中在将海藻酸钠与抗菌因子复合制备抗菌材料，例如Seo等[20]研究海藻酸钠和纳米银溶液混合制备得到复合海绵，其抑菌性较高并且具有抗炎特性，对金黄色葡萄球菌及克雷白氏肺炎杆菌的抑制作用明显。乳酸链球菌素能对嗜热脂肪芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等各种革兰氏阳性菌的营养细胞和芽孢进行有效抑制并且对肠道内菌群没有影响，是天然的食品防腐剂[21]。此外，还可使食品的灭菌温度降低、灭菌时间缩短[22]。

本研究以添加抗菌剂和天然高分子聚合物共混制备可食用膜，从而达到保持食品原有营养成分、风味以及色泽，延长对生鲜肉制品、香肠以及酱卤肉制品的货架期的目的，同时价格低廉并且具有良好的抗菌效果。多元共混制备可食用膜可以降低成本，更适于生产使用对食品包装行业有较大的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

普鲁兰多糖（pullulan，PLU） 东京化成工业株式会社；海藻酸钠（sodium alginate，SA）、甘油 北京试剂厂；乳酸链球菌 北京迪朗生化科技有限公司；平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基 北京陆桥技术有限责任公司；其余试剂为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

AL104电子天平、pH测定仪 瑞士Mettler-Toledo公司；LCH-18恒温水槽 日本三洋株式会社；烘箱

日本Toyo Seisakusho公司；尤尼柯2800可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 邦西仪器科技（上海）有限公司；DZ-600/2S真空包装机 山东小康机械有限公司；GI54DWS高压蒸汽灭菌 致微（厦门）仪器有限公司；F1-45培养箱 日本东洋公司；Nicolet iS10 FTIR傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；SU8010高分辨场发射扫描电镜（scanning electron microscope，SEM） 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 普鲁兰多糖-海藻酸钠共混膜的制备

海藻酸钠溶液（1.5 g/100 mL）的制备：将7.5 g海藻酸钠溶于含有500 mL去离子水的烧杯中，磁力搅拌6 h，至其完全溶解，制成1.5 g/100 mL海藻酸钠溶液，超声30 min脱气泡备用。

普鲁兰多糖溶液（2 g/100 mL）的制备：将10 g普鲁兰多糖溶于含有500 mL去离子水的烧杯中，40 ℃条件下搅拌1 h，至其完全溶解，制成2 g/100 mL普鲁兰多糖溶液，静置备用。

普鲁兰多糖-海藻酸钠共混膜的制备：将上述普鲁兰多糖和海藻酸钠溶液按照体积比1∶1、2∶3、1∶2和1∶3的配比混合，并加入2%的甘油，磁力搅拌2 h，然后超声30 min后静置，形成均匀混合液记为P1、P2、P3和P4，上述方法制备的薄膜放置在温度为（25±2）℃的环境下4～5 d。

1.3.2 乳酸链球菌素-普鲁兰多糖-海藻酸鈉共混膜涂膜工艺

将质量浓度分别为1、2、3、4 g/L的乳酸链球菌素加入上述混合液P2中，磁力搅拌2 h，超声30 min后静置，制备得乳酸链球菌素-普鲁兰多糖-海藻酸钠共混膜液，记为NP2-1、NP2-2、NP2-3、NP2-4。

将刀具和菜板用75%的酒精消毒并紫外照射20 min，取猪梅肉（冷却温度0～4 ℃）切成40 g左右的肉块。将生鲜肉样品分别在含不同质量浓度乳酸链球菌素的成膜液中浸渍60 s，取出置于用75%酒精消毒过的不锈钢网架上，自然条件下成膜后装于聚乙烯自封袋中密封，于4 ℃冰箱中贮藏，分别在贮藏0、2、4、6、8、10、12、14、16 d各取适量鲜肉测定菌落总数、pH值以及色泽的变化。空白组为未加成膜液的肉样。

1.3.3 乳酸链球菌素-普鲁兰多糖-海藻酸钠共混膜的性能表征

1.3.3.1 红外光谱的测定

利用傅里叶变换红外光谱仪采集光谱图。测定可食用共混膜在波数4 000～600 cm-1范围的吸收光谱，分辨率为4 cm-1，波数精度为0.01 cm-1，扫描次数32 次，环境温度25 ℃。以OMNIC 8.0软件分析采集的谱图。

1.3.3.2 透光率的测定

用手术剪刀将共混膜剪裁成1 cm×4 cm的长方形，贴于比色皿透光面，于UV-2800紫外分光光度计中在波长为800 nm处测定透光率T。以空白为对照（T=100%），平行测量3 次，取平均值。

1.3.3.3 溶解度的测定

用手术剪将共混膜修剪为20 mm×20 mm的正方形，于100 ℃的烘箱中烘至恒质量，记为m1，然后将其置于装有50 mL去离子水的三角瓶中，室温下浸渍24 h，之后取出拎干，再于100 ℃的烘箱中烘至恒质量，记为m2。

式中：m1为初始质量/g；m2为溶解后质量/g。

1.3.3.4 微观形貌的测定

将共混膜在50 ℃条件下恒温干燥6 h，避免电镜观察时出现放电现象，取3 mm×3 mm的尺寸粘于样品台，真空镀金30 min。于扫描电子显微镜下在电子束电压5 kV、放大倍数500 倍的条件下观察表面结构。

1.3.3.5 菌落总数的测定

参照GB 4789.2—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[23]中的方法测定。

1.3.3.6 pH值的测定

参照GB/T 9695.5—2008《肉与肉制品 pH测定》[24]中的方法测定。将肉样在无菌条件下用灭菌后的刀剁碎后取10.0 g加生理盐水90 mL混匀，浸泡20 min并不时搅拌，然后用pH测定仪测定其pH值。每个样品重复测3 次，结果以平均值表示。

1.3.3.7 色差的测定

开机自检，用白板进行校正。将肉样切片，测量其亮度值（L*）和红度值（a*），每测1 次顺时针旋转60°，总共测3 次。可测定肉样本身的颜色和光泽及各检样间的色度差值。

1.4 数据处理

所有测试均进行3 次重复，取平均值。采用Excel进行数据分析；Origin 8.0进行数据整理和制图；SPSS 22.0软件进行数据分析。同一系列不同字母表示显著差异（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 普鲁兰多糖与海藻酸钠共混膜的制备优化结果

2.1.1 不同配比普鲁兰多糖与海藻酸钠共混膜的红外光谱分析

红外光谱从分子特征吸收峰鉴定化合物的官能团和结构，可以反映原料组分分子间的相互作用，在干燥成膜的过程中普鲁兰多糖和海藻酸钠分子间发生相互作用，特别是氢键会对可食性共混膜的性能产生影响[25]。共混膜没有出现新的吸收峰，说明PUL和SA的共混过程中没有新的化学键产生。

2.1.2 不同比例普鲁兰多糖与海藻酸钠共混膜的透光率

共混膜的透光率是判断高分子聚合物之间相容性的辅助手段，若共混膜中两相多糖相容性很差，则在相界面上由于光的散射或反射而使膜的透光率降低[27]。由图2可知，本实验制备的共混膜在肉眼条件下均为透明度较好的薄膜。不同配比的共混膜透光性由大到小依次为：PUL∶SA=1∶1>PUL∶SA=2∶3>PUL∶SA=1∶2>PUL∶SA=1∶3，并且透光率都大于80%。随着海藻酸钠组分比例的提高，膜的透光率下降。透光率最优的膜（PUL∶SA=1∶1）在可见光区800 nm波长处的透光率达到95.57%，PUL∶SA=2∶3的透光率为89.03%，PUL∶SA=1∶2的透光率为85.43%，透光性最差的PUL∶SA=1∶3的膜透光率也达到80.43%。可以看出，不同配比的膜都具有较高的透光率，表明了共混膜中不同组分之间的相容性良好，没有发生相分离和相转变的情况，并且透光性好也印证了共混膜的在扫描电子显微镜观察下表面粗糙度小的结论。

2.1.3 不同比例普鲁兰多糖与海藻酸钠共混膜的溶解度

由图3可知，共混膜PUL∶SA=1∶1的溶解度为36.66%，PUL∶SA=2∶3的溶解度为31.31%，PUL∶SA=1∶2的溶解度为44.58%，PUL∶SA=1∶3的溶解度为38.73%。因为成膜基质都是亲水性物质，24 h测得的水溶性都较大。其中，PUL∶SA=2∶3与其他配比相比溶解度较小，这是因为成膜的过程伴随着温度的升高和水分蒸发，2 种物质的高分子链段产生三维互穿网络结构并且由于存在分子间氢键的作用导致成膜结构更为致密，因此溶解度相对其他的体积比例更小。

2.1.4 不同比例普鲁兰多糖与海藻酸钠膜的扫描电子显微镜表征

图4是不同比例可食用膜的扫描电镜图。膜有较好的微观结构形貌则共混膜的相容性较好，所有的样品表面都没有出现相分离和多相结构，这说明采用流延成膜的方法制备的膜具有较好的相容性，共混膜无明显相分离的现象发生。其中，PUL∶SA=2∶3时，粗糙度最小，說明该比例下膜的相容性和均一性最好，而PUL∶SA=1∶1和PUL∶SA=1∶2的粗糙度都比PUL∶SA=2∶3大，并且PUL∶SA=1∶3时，共混复合膜已出现横纹，粗糙度最大。SEM的数据与红外光谱的结果一致，表明体系相容性最好的为PUL∶SA=2∶3。

2.2 共混膜在生鲜肉中的保鲜效果

2.2.1 菌落总数的测定

NP2-1、NP2-2、NP2-3和NP2-4分别为4.80、4.32、4.28、4.25 （lg（CFU/g）），为二级鲜肉。实验组生鲜肉菌落总数与对照组相比有明显的下降。说明采用可食用复合共混膜可以有效地延长生鲜肉货架期。NP2-1可以延长货架期到14 d，NP2-2、NP2-3与NP2-4可延长至16 d，之后变质为腐败肉。所以综合考虑各项检测指标，复合共混膜的最佳配比为NP2-2，此比例下涂布共混膜的生鲜肉货架期可以达到16 d。

2.2.2 pH值的测定

pH值等理化指标是判断肉和肉制品微生物腐败的重要指标，一级鲜度的pH值范围是5.7～6.2，二级鲜度pH值的范围为6.2～6.7，pH值>6.7为腐败肉品。pH值下降的速率和程度对贮藏过程中肉的颜色、系水力以及细菌的繁殖等均有影响[29]。图6为贮藏期间肉样pH值的变化。

由图6可知，随着贮存时间的延长，肉样的pH值呈上升趋势。原因为肉品中蛋白质被分解为呈碱性的氨及胺类化合物等有机碱，从而利于细菌的繁殖，使得pH值趋于碱性。而贮存时间越久，氨及胺类化合物积累的越多，pH值越大。对照组在贮藏第6天的pH值达到6.74，已经为腐败肉；NP2-1组在贮藏第14天pH值为6.76，

NP2-2、NP2-3和NP2-4组在贮藏第16天的pH值超过6.7成为腐败肉。此数值与生鲜肉菌落总数的结果相符，说明共混复合膜具有抑菌作用，可以使蛋白质分解速率减缓，且NP2-2为最佳比例的抑菌复合膜。

2.2.3 色度的测定

由表1可知，对照组和处理组相比，随着贮藏时间的延长，肉样之间L*没明显变化，表明处理后对肉品透明度影响不大。对照组和处理组相比，a*略降低，肉品颜色变差，这说明肌肉色素蛋白发生了变性，肌红蛋白氧化生成其他的衍生物，导致a*降低[30]，而处理组之间a*差别不大。

3 結 论

通过研究表明，经过调整共混膜的工艺条件，改变普鲁兰多糖和海藻酸钠的配比，发现二者共混后，因为存在氢键作用使得两相之间相容性好，不同配比共混膜中不同组分之间的相容性良好，没有发生相分离和相转变的情况。并通过测定膜透光度、溶解度、SEM微观形貌的表征得到具有抑菌性能的多元共混可食用膜最佳配比为PUL∶SA=1∶2。通过肉的菌落总数、pH值、色差等指标检测表明，当添加乳酸链球菌素质量浓度为2 g/L时，该可食用抗菌共混膜的抑菌性能最好，此方法制备的抑菌性可食用膜，可以有效延长食品的货架期到16 d。

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