超声波处理对多糖理化性质和生物活性的影响

邱军强，张华，刘迪迪，贠可力，李景彤，王振宇

（哈尔滨工业大学化工学院，黑龙江哈尔滨150090）

超声波处理对多糖理化性质和生物活性的影响

邱军强，张华，刘迪迪，贠可力，李景彤，王振宇*

（哈尔滨工业大学化工学院，黑龙江哈尔滨150090）

对近年来超声波降解多糖的研究进展进行综述，详细介绍超声波对多糖物理化学性质、生物活性的影响，主要包括抗氧化活性、抗肿瘤活性、抗菌活性、免疫调节活性等。并初步分析超声波的作用机理，为今后超声波降解多糖的研究发展提供一定的理论依据。

超声；降解；多糖；物化性质；生物活性

利用超声声场降解生物大分子的研究已在环境、化工、食品等领域得到高度关注，多糖作为一类自然界存在最多的高分子量的生物活性物质。研究发现许多天然多糖具有提高免疫[1]、降血糖[2]、抗病毒[3]、抗衰老[4]、抗癌[5]和抑菌[6]等多种生物学活性。然而由于多糖分子量范围广，结构极为复杂，且生物利用度低，对于研究其理化性质及生物功能均受到一定的限制。随着对多糖生物活性的研究，大量文献报道表明，多糖的高级结构、侧链的连接位置、分支密度及单糖间糖苷键的结合方式均与其生物活性密切相关。此外多糖的聚合度、分子量也影响其生物活性。通过多糖降解进行研究开发多糖逐渐成为国内外研究学者关注的热点；目前多糖降解方法主要包括物理降解法、化学降解法和生物学方法（如：酶降解法）。近年来国内外大量研究人员争相报道超声波对多糖（如：刺槐豆胶[7]、壳聚糖[8-9]、葡聚糖[10]和其他天然多糖等等）理化性质、分子结构和生物活性的影响。如：多糖分子量、多糖黏度、异头碳构型、单糖组成、分支度以及空间结构等等，与其它方法相比较，超声降解法成本低廉，同时节省能源和时间，操作程序简便，无需使用有毒有害试剂，同时基本不产生废弃物，工业化前景广阔[11]。

1 超声波降解多糖的机理

超声波与声波一样，为物质介质中的一种弹性机械波，而根据其工程学特性将其分为检测超声和功率超声，其中检测超声为高频低能型超声波，其应用的频率范围为5×105Hz～5×107Hz之间，能量一般低于1 W/cm2，主要应用于无损检测和物质物化特性的诊断方面；后者为低频高能型超声波，其应用频率低于100 KHz，而能量高于1 W/cm2，其强大的能量能够使得介质发生物理裂解，能够有效的改变物化特性并加速某些化学反应的发生，近年来功率超声已成为以物理、机械振动、电子材料等学科为基础的高新技术之一，功率超声已在机械、冶金、材料、化工、食品、医药、纺织及节能环保等许多重要领域得到广泛的应用[7-9]。超声波在液体媒介中传播时能够产生力学、热学、光学、电学和化学等一系列物理化学效应，其中包括辐射压力、直进流作用、空化效应和不稳定的界面等。目前研究认为，超声波降解多糖的主要机理为机械性断键作用和空化效应。超声波的机械性断键作用是由于物质的质点在超声波中具有极高的运动加速度，从而产生激烈而快速变化的机械运动，这种快速变化的机械运动足以引起多糖这类生物大分子主链较为敏感的化学键断裂，同时不会引发多糖化学性质完全改变，而使得多糖发生自身降解[12]；此外超声空化作用产生的高温高压条件足以打开结合力强的化学键（约377 kJ/mol～418 kJ/mol）[13]。自由基的氧化还原反应主要是由于液体在超声波作用下，液体内部或者液固交界面上蒸气或气体，进入空穴，形成不同大小的气泡而形成空化效应而导致的。当声波在媒介中传播时，若声强足够大，液体所受到的负压也足够大，媒质分子间的平均距离就会增大，超过极限距离后，破坏液体结构的完整性，造成空穴。这些空穴破碎时会产生局部性的高压和剧烈的温度变化，为自由基的产生提供能量。另外溶解样品溶剂类型不同，其形成的自由基也不相同，所造成的超声波的反应结果也不相同。自由基和热效应对低分子量多糖的降解较为有效，而机械效应对高分子多糖的降解效应更为显著，而且机械效应随多糖分子量的增加而增加。另外影响超声空化作用的因素主要包括超声系统、超声体系性质（如体系蒸气压、温度、溶剂和溶液中气体种类等）和超声波反应器的结构。部分学者认为机械效应所作用的位点靠近最大分子的中心，其中当多糖糖链长度超过特定尺寸时，超声波可能直接通过空穴效应产生的摩擦力使得多糖发生降解[14]。此外超声波在液体中引起空化效应，能够产生约4 000 K和100 MPa的瞬间局部高温和高压环境，从而使得水分子在这种环境下达到超临界状态，进而分解成羟自由基、超氧基等；而羟基自由基作为活性最强的强氧化剂，因此能够引发局部有机物发生化学键断裂、水相燃烧、高温分解、超临界水氧化和自由基氧化等反应，进而发挥其降解效应。

2 超声波处理对多糖物理化学性质及结构的影响

目前研究表明超声波对多糖理化性质及结构的影响主要集中于流变学特性、单糖组成比例、摩尔分子量、空间微尺寸和空间构象等[12]。超声波降解多糖效应主要与超声功率、超声处理时间、超声温度以及多糖浓度密切相关。

超声波降解多糖的化学效应主要基于溶液中多糖的羟基和氢自由基，同时与低频超声波相比，高频超声波具有更剧烈的超声效应，同时发现超声波首先会引起多糖空间构象改变以及特性黏度和分子量降低。Li等[15]通过研究不同超声时间对分子量为1.3 kDa～5×104kDa黄原胶黏度的影响，发现随着超声时间的增加，黄原胶的特性黏度在不断降低，应用ηsp/C=[η]+ k[η]2C数学模型（其中ηsp为增比黏度，ηsp/C为比浓黏度，代表单位浓度下所显示出的黏度，k为常数，[η]为特性黏度，其反映了高分子与溶剂分子之间的内摩擦。），进行计算得到降解0、5、10、30 min黄原胶的特性黏度分别为16.91、5.65、4.03、3.77 dL/g，而应用ηrel= 1+[η]C数学模型（其中ηrel为相对黏度值。），进而计算得到降解0、5、10、30 min黄原胶的特性黏度分别为38.30、5.97、4.40、2.95 dL/g，结果表明当多糖链结构达到一定长度并趋于缠绕时，分子间的相互作用会对超声降解的效应产生显著的影响。Zhang等[16]在研究超声对苹果果胶结构和流变学性能的影响时，发现超声的强度和温度对多糖的降解效应影响最为明显，苹果果胶分子量分布随着超声时间和强度增加变得更加均一和狭窄，但是超声降解对苹果果胶的主链组成和单糖组成基本没有影响，而使得中性糖侧链尺寸减小，同时红外光谱分析表明超声降解使得苹果果胶甲基化程度降低，此外，与原苹果果胶相比，超声降解处理后的苹果果胶黏度降低了103倍。Zou等[17]通过研究超声波对7个不同初始分子量葡聚糖的影响时，发现随着超声波处理时间的延长，葡聚糖的分子量和分散度在不断降低，同时葡聚糖的初始分子量越大，溶液浓度越低降解的进程就越快；最后得到的降解葡聚糖溶液更均一，且分子量更低。Zhang等[18]通过比较超声波降解、超声波辅助酸降解和酸降解3种降解方法对柑橘果胶的降解作用，发现超声波降解处理对柑橘果胶的主链没有改变，超声波处理后的果胶中仅含有线性链结构，同时发现经超声波降解处理后的果胶具有更低的酯化水平，原子力显微镜分析表明超声波降解处理后果胶直链长度缩短，分支度降低，由此表明超声波降解具有节省时间，反应条件温和及环保等诸多有点。Zhong等[19]通过研究超声波对裂褶菌多糖的影响时，发现超声功率为796 W/cm2，超声时间为30 min，裂褶菌多糖分子量由2.40×103kDa降低至3.89×102kDa。大部分较大分子量片段（106Da～107Da）经过超声处理后其分子量降低为104Da～105Da；同时超声波处理使得裂褶菌多糖的分子量分布更为均一。Wang等[20]通过研究超声波对冬虫夏草多糖降解作用时，发现给予10 min超声频率为20 kHz，超声功率为35 W/cm2或者更高功率的超声波处理后，冬虫夏草多糖的表观黏度和特性黏度降低了近85%，其水溶性增加了接近4倍；超声波处理使得冬虫夏草多糖中最大分子量的多糖分子量显著降低，同时使得其分子量分布更加均匀，而对多糖分子结构没有影响；而酸降解仅仅使得其特性黏度降低了20%，表明超声波降解多糖为一种行之有效的改善大分子量多糖溶解性的方法。王鹤等[21]在研究超声波对密花石斛多糖理化性质的影响时，发现超声波功率密度为300 W/cm2和600 W/cm2时能够显著降低大分子量密花石斛多糖的相对分子量，而对小分子量密花石斛多糖无明显影响；同时，超声处理后密花石斛多糖的特性黏度也呈下降趋势，并与超声功率呈正相关；此外超声波处理能够使得密花石斛多糖的空间构象发生改变，大纺锤体状会解聚为尺寸更小、形状相似、结构紧密的小聚集体及多糖碎片，同时发现大聚集体的解聚程度与超声功率正相关。

3 超声波降解法对多糖生物活性的影响

目前多糖在世界范围内由于其生物活性受到广泛的关注。大量的动物和临床研究表明多糖在人体内起着非常重要的作用。越来越多的国内外学者开始利用超声波降解对多糖生物活性进行改善，进而与天然多糖生物活性进行对比研究。

3.1 超声波处理对多糖抗氧化活性的影响

自由基的产生是引起机体产生病变的重要原因，当人体内存在过多的自由基会引发一系列的疾病，目前已发现100多种疾病都与自由基过剩有关，试验研究表明多糖类化合物具有清除自由基、抑制脂质过氧化、抑制亚油酸氧化等抗氧化作用；因此大量研究学者开始关注超声波降解对多糖抗氧化活性的影响。Guo等[22]在研究不同超声时间对岩藻聚糖抗氧化活性的影响时，发现超声降解处理60 min对DPPH自由基清除活性达到最大，而超声降解处理120 min对氧自由基的清除活性达到最大；而后随着降解时间增加其抗氧化活性逐渐降低，推测超声降解处理分为两个阶段：当超声处理第一阶段时，随着分子量的降低，其分子内氢键发生轻微变化从而产生较多游离的羟自由基和氨基；同时在相同质量浓度下，较低分子量多糖含有相对较多的还原性糖；然而在超声处理的第二阶段，随着超声降解处理岩藻多糖的深入，其对多糖分子量的降解速率降低，对多糖结构的破坏性增加从而产生更多的自由基，使得其抗氧化活性降解，由此表明控制超声处理时间对多糖分子量和抗氧化活性至关重要。Tang等[23]采用超声波降解处理青钱柳叶多糖后，与未降解多糖相比，超声波降解后多糖中糖含量、糖醛酸含量和蛋白含量没有发生显著改变，而其单糖阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和半乳糖醛酸的组成比例由1.0∶4.6∶3.5∶4.5变为1.0∶5.9∶3.9∶4.4，而超声波降解后多糖具有更好的DPPH清除活力和羟自由基清除活力，提示多糖中单糖的组成比例可能与其抗氧化活性密切相关。

3.2 超声波处理对多糖抗肿瘤活性的影响

抗肿瘤活性是多糖的一个重要生物活性，其机制是通过多糖的免疫调节作用激活免疫细胞，诱导多种细胞因子和细胞因子受体基因的表达，增强机体抗肿瘤相关的免疫功能，从而间接抑制或直接杀死肿瘤细胞。Yu等[24]发现未经超声波降解条斑紫菜多糖和经超声波降解多糖对胃癌细胞SGC7901最大抑制率分别为12.5%和32.5%；而对95D细胞最大抑制率分别为18%和21%。据报道，多糖的抗增殖活性主要与多糖分子量、化学成分、主链结构和支化度密切相关，其中多糖分子量对其抗增殖活性具有显著影响，可能是由于分子量的降低能够增强多糖硫酸基团与肿瘤细胞蛋白之间的相互作用。Zhu等[25]以古尼虫草多糖作为研究对象，通过正交试验设计考察超声功率、超声时间和多糖浓度对降解古尼虫草多糖抗肿瘤活性的影响，发现当超声功率为400 W，超声时间为15 min，多糖浓度为1 g/L降解处理的古尼虫草多糖抗肿瘤活性达到最大，其对H22肿瘤细胞的抑制率可达83.3%，超声波降解显著提高古尼虫草多糖抗肿瘤活性，同时发现其对古尼虫草多糖的单糖残基和糖苷键组成没有影响，而能够使得多糖分子量、特性黏度和空间非对称性降低，表明多糖分子量、特性黏度和空间结构与其抗肿瘤活性具有密切关系。

3.3 超声波处理对多糖抗菌活性的影响

Liu等[26]通过研究超声波对4种不同分子量和脱乙酰度壳聚糖（分子量分别为6.55×105、1.54×106、7.75×105、4.47×105kDa；脱乙酰度分别为61.9%、72.1%、87.1%和91.6%。）的影响，发现超声降解后壳聚糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗增殖活性增加；表明其抗菌活性与壳聚糖分子量的大小密切相关。另外多糖发挥抗菌活性主要作用的靶点可能为细菌细胞壁，胞质膜和DNA等，从而能够解决耐药性的问题，为开发可食用抗菌剂提供一定的应用价值。

3.4 超声波处理对多糖免疫调节活性的影响

多糖发挥免疫调节活性主要通过诱导产生多种细胞因子，如促进干扰素、白细胞介素等，从而激活巨噬细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）和淋巴细胞等免疫细胞，激活网状内皮系统和补体系统，从而提高机体特异性和非特异性免疫功能，进而发挥其免疫调节活性。Yao等[27]对从薏苡仁种子中分离得到的两个多糖进行超声降解处理，发现两个多糖分子量分别由94.2 kDa和82.3 kDa被降解为63.1 kDa和60.4 kDa；而两个多糖经超声波处理后单糖组成没有发生变化，其单糖摩尔比例发生了细微改变，而经过超声波降解处理后二者促进小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌NO、TNF-α和IL-6的能力增加；表明超声波降解多糖能够提高多糖的免疫调节活性，且其免疫调节活性可能与多糖中的单糖组成比例密切相关。汪鹤等[21]采用超声波对密花石斛多糖进行降解发现，与未经超声波降解组相比，经300 W超声处理后的多糖促进小鼠脾细胞增殖活性明显升高，这可能是因为超声处理使多糖的大聚集体解聚成小的多糖碎片，使其更易进入细胞发挥生物学效应；当超声功率为600 W时，其活性反而有所降低，表明过高超声功率降解处理多糖可能会破坏多糖特定的活性结构，进而导致多糖活性下降。肖建辉等[28]在研究超声波降解处理对古尼虫草菌丝体多糖免疫调节活性的影响时，发现超声波处理后的古尼虫草菌丝体多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖、腹腔巨噬细胞吞噬功能以及细胞毒T淋巴细胞活性的免疫抑制效果明显增强，尤其在10 μg/mL和100 μg/mL剂量时的抑制效果更好。古尼虫草菌丝体多糖并不随超声波降解时间的延长而提高其免疫抑制活性，降解1 h～2 h和4 h～8 h的抑制效果没有显著的差异。

4 展望

多糖已逐渐成为继蛋白质和核酸之后，人类生命科学研究领域里的又一个新的里程碑，但是由于其分子量范围广，结构极为复杂，且生物利用度低等限制了多糖资源的开发与利用；同时大量文献报道超声波降解能够显著改善多糖的多种生物活性，进而提高多糖药用价值。其降解机理在于：改善多糖在机体的药代动力学特性提高其利用度；使得大分子多糖中功能基团得以释放。但是多糖类物质分子量分布广泛，空间结构复杂，单糖组成和比例不一，对超声波功率，超声时间和超声温度对多糖的降解效应研究还不够全面，因此亟需对降解处理的多糖进行系统研究，由于超声波降解多糖具有成本低廉，节省能源和时间，操作简便，无需有毒有害试剂，同时基本不产生废弃物等诸多优点，因此利用超声波对多糖进行降解，进而研究其理化性质及生物功能具有十分重要的意义。未来的研究应主要集中于a.研究不同超声参数（如超声功率，超声时间和超声温度等）对多糖生物活性的影响机理，特别是与单糖组成的关系；b.关注超声对多糖空间微结构的影响；超声降解多糖的研究报道已经取得了一定的成果，但是超声降解多糖的药学价值和食品化工领域的应用价值仍有待进一步的研究开发。

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Effect of Ultrasound Degradation on Physical and Chemical Properties and Biological Activity of Polysaccharides

QIU Jun-qiang，ZHANG Hua，LIU Di-di，YUN Ke-li，LI Jing-tong，WANG Zhen-yu*
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，Heilongjiang，China）

Literatures about ultrasonic degradation of polysaccharides reported in recent years that were reviewed，the effect of ultrasonic degradation on the physical properties，chemical properties and biological activity of polysaccharides were summarized，including antioxidant；antitumor；antibacterial；immunoregulatory activity and so on.In addition，the mechanism of ultrasonic wave was analyzed at the same time，so as to provide a theoretical basis for the study and development of ultrasonic degradation of polysaccharides in the future.

ultrasound；degradation；polysaccharides；physical and chemical properties；biological activity

2016-11-01

黑龙江省教育厅科研项目（12543044）；国家自然科学青年基金（31401483）；黑龙江省博士后基金（LBH-Z14098）；中央高校基本科研业务费专项资金资助（HIT.NSRIF.2017025）

邱军强（1988—），男（汉），博士研究生在读，研究方向：天然产物开发。

*通信作者：王振宇（1957—），男（汉），博士生导师，研究方向：天然产物开发与应用。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.041