两株好氧反硝化聚磷菌的筛选、鉴定及水质净化研究

聂毅磊 贾纬 曾艳兵 罗立津 陈星伟 庄鸿 陈宏

（1. 福建省微生物研究所 福建省新药（微生物）筛选重点实验室，福州 350007；2. 江西省农科院质标所，南昌330200）

两株好氧反硝化聚磷菌的筛选、鉴定及水质净化研究

聂毅磊1贾纬1曾艳兵2罗立津1陈星伟1庄鸿1陈宏1

（1. 福建省微生物研究所 福建省新药（微生物）筛选重点实验室，福州 350007；2. 江西省农科院质标所，南昌330200）

旨在从环境样品中筛选对富营养化水体具有良好脱氮除磷效果的好氧反硝化菌。采集福州某养猪场污水处理池中的水样。通过反硝化细菌培养基培养、BTB培养基平板分离、硝酸盐还原试验和蓝白斑筛选法、异染颗粒以及聚-β-羟基丁酸（PHB）颗粒染色试验，筛选获得两株具有脱氮除磷特性的菌株，命名为N1和N2。经16S rRNA 基因序列分析，N1和N2分别属于无色杆菌属（Achromobacter.sp）和短波单胞菌属（Brevundimonas.sp）。将菌株N1和N2复配，获得脱氮除磷复合菌FIM-1。考察了菌株对人工合成污水和富营养化水体脱氮除磷的效果。结果表明，两株菌在含磷量较低的水体中，对磷的去除率较高，相对于单菌，复合菌表现出更佳的脱氮除磷效果。

好氧反硝化；聚磷菌；脱氮除磷；富营养化

富营养化（Eutrophication）是指在人类活动影响下，水体接纳了过量的氮、磷等营养物质，造成水质恶化、水体生态系统和水功能受到阻碍和破坏的现象［1，2］。氮、磷污染物是导致水体富营养化的主要因素，它们的协同去除是污水生物处理的主要目标。传统的生物脱氮除磷过程中，反硝化细菌和聚磷菌之间往往因碳源竞争、泥龄适应不统一等问题使得传统的生物脱氮除磷工艺有着自身难以解决的矛盾［3］。20世纪80年代以来，研究者发现了在有氧条件下利用好氧反硝化酶进行反硝化作用的好氧反硝化菌［4，5］，从而拓宽了传统厌氧反硝化现象的认识。此类现象也使好氧条件下同时完成反硝化和除磷两种功能成为可能，有效地解决了原有反硝化除磷技术不同步的矛盾。

在污水处理的工程中多采用A/O、A2/O、O/A等工艺，这些工艺在工程应用中占地大、成本高、运行周期长。好氧反硝化菌的应用，可以使硝化反硝化在同一环境下同时进行，大大减少占地面积和建设资金。反硝化过程中产生的碱度可以部分补偿硝化过程中损失的碱度，能使系统中的pH值保持相对稳定。反硝化阶段不需要另外添加碳源，可以减少碳源，降低成本。尤其在水产养殖水体污染物的去除上，由于亚硝酸盐氮和可溶性磷的有效去除是水产业亟需解决的关键问题之一，在鱼虾养殖过程中必须充氧来保证水中的溶解氧量，好氧反硝化除磷菌的筛选与应用为解决该问题提供了思路。

本研究从福州某养猪场污水处理池中的水样中筛选获得两株具有在好氧状态下脱氮聚磷效果的反硝化聚磷菌，并考察了菌株对人工合成污水和富营养化水体脱氮除磷的效果，旨在为好氧反硝化除磷技术的应用与推广提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基 BTB 培养基［6］；限P和P过量的葡萄糖-MOPS 固体培养基［7］；硝酸盐还原培养基［7］YG培养基［7］；反硝化细菌培养基［7］；反硝化除磷培养基（mg/L）：琥珀酸钠4.72，NaNO20.05，KH2PO40.09，MgSO4·7H2O 1.0，pH7.2；人工合成污水（mg/L）：葡萄糖360，酵母膏80，磷酸二氢钾 14，七水硫酸镁 24，氯化铵 60，氯化钙 18，碳酸氢钠 24，七水硫酸锰 6，三氯化铁 0.3，亚硝酸钠30，硝酸钾 30，pH7.0，1000 mL水。

1.1.2 主要试剂 格里斯（Griess）试剂Ⅰ：磺胺酸0.5 g，溶于150 mL醋酸溶液（30%），棕色瓶保存。格里斯（Griess）试剂Ⅱ：a-萘胺 0.5 g，加入50 mL蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入100 mL醋酸溶液中，保存于棕色瓶子中。二苯胺试剂：二苯胺0.5 g溶于100 mL浓硫酸中，用20 mL蒸馏水稀释。所用化学试剂均为分析纯。

1.1.3 主要仪器 Nikon fci-LZ生物显微镜（NIKON仪器（上海）有限公司）；紫外分光光度计（SP752，上海光谱仪器有限公司）；ZHWY-3112B摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）；PCR扩增仪（S1000，Bio-Rad公司）；电泳仪（6003EN，上海申能博彩生物科技有限公司）；HH-4恒温水浴锅（上海江星仪器有限公司）；5B-1（F）型COD快速测定仪（联华科技）。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 污水样品采集自福州某养猪场污水处理池中的水样。

1.2.2 菌种分离 吸取5 mL水样，加入0.8%无菌生理盐水100 mL，混匀。按5%（v/v）比例接入反硝化细菌培养基中，于28℃、120 r/min的摇床上振荡富集培养5 d。用0.8%无菌生理盐水稀释富集培养液，采用梯度稀释及涂布法，将培养液均匀涂布于BTB培养基，28℃培养1-2 d。挑取周围培养基出现蓝色的单菌落为初筛菌，将菌体接种至装有10 mL硝酸盐还原培养基的试管中，培养1、3、5、8 d。每株细菌做3个平行样，并设置不接种的体系作为对照。选取硝酸盐还原阳性的的菌株点种于限磷和磷过量的葡萄糖-MOPS培养基，28℃培养1-2 d。观测蓝白斑的生长情况。挑取在两种培养基上同时都产生蓝斑的菌株，接入反硝化除磷培养基，培养30 h。挑选能够在有氧条件下高效去除亚硝酸盐氮及PO43--P 的菌株，接种到YG培养基中，厌氧培养24 h。挑取细菌，按常规制成涂片，采用苏丹黑染色法进行PHB染色［8］。再好氧培养24 h。挑取细菌，按常规制成涂片，利用Albert染色法进行Poly-P染色［9］。

1.2.3 菌种DNA的提取、扩增和分析 取培养至对数生长期的菌液5 mL，8 000 r/min离心10 min，倾去上清液，收集菌体。采用CTAB/NaCl法［10］提取菌体基因组DNA。步骤如下：菌体中加入1.35 mL TE溶液（pH8.0），悬浮，加入0.3 mL 10%十二烷基硫酸钠（SDS）、100 μL 100 mg/mL溶菌酶和100 μL 100 mg/mL蛋白酶K，混匀，60℃水浴1 h，加0.25 mL 5 mol/L NaCl和0.2 mL CTAB/NaCl溶液，65℃水浴10 min，以等体积的苯酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇各抽提1次，异丙醇沉淀DNA，DNA溶于50 μL TE中，-20℃保存备用。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA完整性。采用16S rRNA基因的通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）对提取的DNA进行PCR 扩增。将扩增后的DNA 产物送至上海生物工程有限公司进行测序。用BLAST软件与NCBI的GenBank数据库收录的的16S rRNA序列进行比对分析。

1.2.4 菌株拮抗试验 采用平板对峙法观察菌株之间有无拮抗作用，选取其中一株菌作为指示菌，其余菌株以十字划线的方式接种到含有指示菌的平板上，培养72 h至更长，观察有无抑菌现象的出现。

1.2.5 人工合成污水吸磷实验 用接种环从斜面挑起少量菌体，接入YG培养基中，28℃、120 r/min培养3-4 d至对数生长期，菌液8 000 r/min离心5 min，弃上清液得到菌体，用0.8%生理盐水洗去菌体上的培养基，用无菌水溶解，离心，弃上清液得到菌体，重复3次，获得单株菌菌体。称取等量的以上单株菌菌体混合配比成复合菌剂。

将上述制备的菌体分别以1%的接种量接入人工合成污水中。28℃、120 r/min培养24 h。培养液8 000 r/min离心5 min，吸取上清液测定其中的磷含量。

1.2.6 富营养化水体的净化实验 采集福州某富营养化河水（COD在100 mg/L以下）作为实验对象。量取10 L河水，加入到处理容器中，设置实验组和对照组，实验组分别投加2.5%（v/v）的单菌菌体和复合菌体，在室温下采用间歇曝气方式，即曝气8 h，停曝16 h。不同时间取样测定水中总氮、NO3--N和总磷的含量。

1.2.7 测定方法 总氮采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定，NO3--N采用二苯胺试剂检测；总磷采用过硫酸钾氧化-钼酸铵分光光度法测定［11］。

2 结果

2.1 富集、分离培养

经反硝化细菌培养基富集和BTB平板划线纯化后共获得89个单菌落，其中65株菌硝酸盐还原阳性。从限磷和磷过量的葡萄糖-MOPS培养基上挑取能同时产生蓝斑的单菌落，共获得21个单菌落。对该21株细菌进行反硝化除磷性能的比较研究，最终筛选出两株能够在有氧条件下去除亚硝酸盐氮及PO43--P 的菌株，它们对亚硝酸盐氮的去除率可达80.5 %、84.2%，对PO43--P 的去除率可达87.2 %、80.4%。菌株N1和N2经碱性美蓝染色后显微镜油镜观察（图1，图2）。

图1 菌株N1碱性美蓝染色形态（1 000×）

图2 菌株N2碱性美蓝染色形态（1 000×）

菌株N1和N2经苏丹黑染色法和Albert染色法染色后油镜观察。在培养过程中菌株N1和N2菌体内均有poly-P和PHB累积。由于N1和N2的染色结果相类似，所以以N1的染色图片（图3，图4）为代表。可以看出，菌株N1经苏丹黑染色法染色后，膜内除细胞质外有明显的黑色颗粒，说明胞内有PHB。菌体呈粉红色，类脂粒呈蓝黑色。通常聚磷菌体内PHB为细菌细胞内储存能量的脂质内含物。它分解产生能量，一部分供聚磷菌正常的生长繁殖，另一部分供其主动吸收环境中的磷合成聚磷。图4可以看出，菌株N1经Albert染色法染色后菌体呈绿色，poly-P呈黑色。

图3 菌株N1的PHB颗粒染色

图4 菌株N1的poly-P染色

2.2 菌株16S rRNA的鉴定

用BLAST软件将菌株N1和N2与NCBI的GenBank数据库收录的的16S rRNA序列进行比对分析。N1与 Achromobacter sp. NT 5-04的16S rRNA基因序列的相似性为99%，鉴定为无色杆菌属（Achromobacter sp.）。N2与 Brevundimonas sp. H208和Brevundimonas sp. KACC10191 的相似性分别为100%和99%，鉴定为短波单胞菌属（Brevundimonas sp.）。

2.3 菌株拮抗试验

通过菌株之间的拮抗试验，确定菌株N1和N2之间无拮抗作用，将菌株N1和N2等量配比，获得复合菌FIM-1，进行后续试验。

2.4 人工合成污水吸磷实验

人工合成污水吸磷实验结果（表1）表明，菌株N1、N2和复合菌FIM-1具有一定的除磷效果，但随着水体中磷含量的增加，磷的去除率明显下降，说明这两株菌可能更适合于低浓度磷废水的净化。

表1 菌株对不同磷浓度的人工合成污水中磷的去除率

2.5 富营养化水体的净化实验

富营养化水体的净化实验结果（图5）表明，加入菌剂的试验组的总氮和总磷初始阶段均呈下降趋势，总氮至40 h降至最低，随后上升，对照组的总氮在18 h内上升，18 h后下降（加入N1、N2、FIM-1和对照组CK的总氮在40 h内去除率分别为9.20%、17.16%、32.84%和4.72%）。总磷则至18 h降至最低（加入N1、N2、FIM-1和对照组CK的总磷在18 h内去除率分别为14.04%、8.77%、28.95%和2.63%），随后上升，可能是后期菌体自溶释放出磷，导致水体中磷浓度上升。加入菌剂的实验组对总氮、总磷的去除效果均优于空白对照组，而混合菌对总氮、总磷的去除效果优于单菌。

图5 富营养化水体脱氮（A）除磷（B）实验结果

3 讨论

目前已报道的好氧反硝化细菌主要归属于假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、克雷伯菌属（Klebsiella sp.）、红球菌属（Rhodococcus sp.）、产碱杆菌属（Alcaligenes sp.）、动胶菌属（Zoogloea sp.）、副球菌属（Paracoccus sp.）、苍白杆菌属（Ochrobacterium sp.）、生丝微菌属（Hyphomicrobium sp.）和芽孢杆菌属（Bacillus sp.）等［12-16］，本研究中筛选获得的无色杆菌属（Achromobacter.sp）和短波单胞菌属（Brevundimonas.sp）在好氧反硝化细菌的研究报道中较少见。

虽然好氧反硝化技术引起越来越多的关注，但是在好氧条件下反硝化和除磷的研究报道甚少。于大禹等［17］研究了一株假单胞菌的好氧脱氮除磷的效能。Ma等［18］探讨了不同氧浓度对农杆菌Agrobacterium sp. LAD9脱氮除磷的影响。马放等［19］分离到一株高效除磷的芽孢杆菌。安健等［20］从养虾塘中筛选到在有氧条件下同时具有反硝化和除磷功能的蜡样芽胞杆菌。本研究中筛选获得具有好氧反硝化脱氮除磷特性的无色杆菌属和短波单胞菌属菌株，扩大了好氧反硝化聚磷菌的菌源。

根据生物除磷代谢机理模式可知，厌氧/好氧或厌氧/缺氧环境的交替变化都可以诱导磷的超量吸收，前者以分子氧作为电子受体、后者以NO3-作为电子受体。由于NO3--N 电子受体传递链短、氧化还原电位低，产生ATP 只有氧电子受体的2/3，因此，从生物除磷的角度分析，缺氧吸磷的效果不如好氧吸磷［21，22］。在序批式生物膜工艺中，缺氧反硝化吸磷速率较好氧反硝化吸磷速率明显降低，约为好氧吸磷速率的1/6［23］；方茜等［24］考察了SBR 系统内DO 浓度对反硝化除磷的影响，发现在有氧条件下，更有利于反硝化除磷效率的发挥，因此好氧反硝化聚磷菌在实际废水脱氮除磷工艺中具有更好的应用潜力，应加强对此方面的深入研究。

虽然投加筛选到的某些高效菌株对特定废水进行处理能够在一定程度上弥补活性污泥工艺的不足，但单一聚磷菌在实际应用中因影响因素较多，并不能很好表现超量聚磷特性。本研究也证实了此观点，筛选到的两株反硝化聚磷菌在实际的富营养化水体初步净化试验中，虽然对总氮和总磷具有一定的去除能力，但其脱氮除磷效果尚不理想。但复合菌剂FIM-1表现出比单菌N1和N2更显著的脱氮除磷效果，说明投加优势菌株的生物强化技术在实际应用中，须考虑各类微生物协同脱氮除磷的作用。在加入菌剂的初始期总磷和总氮下降明显，因此可根据此特性调整处理工艺以提高脱氮除磷效率。特定菌株的反硝化特性与碳源类型、碳氮比、温度、盐度、溶解氧和 pH 等因素有关［25-30］，后续将进行该方面的相关研究。

即使是经过运行稳定的污水处理系统处理过的污水（磷含量在1.0 mg/L以下），排入自然水体后，磷含量仍然远远超出使水体呈现安全状态的16-30倍，仍旧会引发“藻华”的爆发，不能有效防止富营养化的发生。所以，在当前污水除磷的基础上，对于已经处理的出水及其它磷浓度相对较低（1.0 mg/L左右）的污水进行进一步的除磷，也是非常必需和重要的。该无色杆菌N1和短波单胞菌N2及其复合菌FIM-1较适合于低浓度磷废水的净化。因而有必要对其在低浓度磷废水净化中的应用做进一步的研究。

4 结论

本实验从福州某养猪场污水处理池的底泥样品中分离获得2株反硝化聚磷菌N-1和N-2，其属于无色杆菌属和短波单胞菌属。将菌株N-1和N-2复配，获得脱氮除磷复合菌FIM-1。富营养化水体的净化实验结果表明，加入单菌N1、N2和复合菌FIM-1的富营养化水体的总氮在40 h内去除率分别为9.20%、17.16%和32.84%，而总磷在18 h内去除率分别为14.04%、8.77%和28.95%，复合菌比单菌表现出更佳的脱氮除磷效果。

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（责任编辑 李楠）

Screening and Identification of Two Aerobic Denitrifying Phosphorusaccumulating Strains，and Denitrifying Biological Phosphorus Removal

NIE Yi-lei1JIA Wei1ZENG Yan-bing2LUO Li-jing1CHEN Xing-wei1ZHUANG Hong1CHEN Hong1
（1. Fujian Institute of Microbiology，Fujian Provincial Key Laboratory of Screening for Novel Microbial Products，Fuzhou 350007；2. Agricultural Product Quality Safety and Standards Institute， Jiangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanchang 330200）

It is aimed to screen highly-efficient aerobic denitrification bacterium simultaneously removing nitrogen and phosphorus（P）from the piggery wastewater sample in a pig farm of Fuzhou. Two effective strains，named as N1 and N2，were acquired by culturing with medium for denitrification strain，then isolating with the BTB streak plate，further screening with the blue- and white-colored spot，and finally dyeing with metachromatic granules and PHB（poly-β-hydroxybutyrate）granule. By 16S rRNA gene sequence analyses，two strains were identified as Achromobacter sp. and Brevundimonas sp.，respectively. Combined strain FIM-1 was formulated with N1 and N2. The effectiveness of their removing the nitrogen and phosphorus in artificial wastewater and eutrophic water was investigated. The results showed that the removal rate of nitrogen by N1，N2，and FIM-1 at 40 h was 9.20%，17.16%，and 32.84% respectively，and the removal rate of total P at 18 h was 14.04%，8.77%，and 28.95%，respectively，indicating that FIM-1 performed better than the single ones.

aerobic denitrification；phosphorus-accumulating organisms（PAOs）；nitrogen and phosphorus removal；eutrophication

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.017

2016-06-16

福建省公益类科研院所专项（2014R1009-9），福建省科技重大专项（2013YZ0001-1），江西省自然科学基金（20142BBF60019）

聂毅磊，男，硕士，副研究员，研究方向：生物工程；E-mail：nie2050@sina.com

陈宏，硕士，高级工程师；研究方向：环境微生物；E-mail：peaceful88@163.com