基于单味药及药对HPLC指纹图谱探讨小青龙汤组方特性＊

张玉苹，王青青，邓秀兰，张晓晶，钟相根

（北京中医药大学中医学院 北京 100029）

基于单味药及药对HPLC指纹图谱探讨小青龙汤组方特性＊

张玉苹，王青青＊＊，邓秀兰，张晓晶，钟相根

（北京中医药大学中医学院 北京 100029）

小青龙汤方出自张仲景《伤寒论》，其组成为麻黄、芍药、细辛、干姜、甘草、桂枝、半夏、五味子。对单味药以及麻黄-甘草药对、麻黄-桂枝药对、白芍-桂枝药对、白芍-甘草药对、五味子-细辛药对的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱分析研究逐渐深入。本文从此角度出发分析小青龙汤组方特性，探讨中医方剂配伍科学内涵。

小青龙汤 单味药 药对 HPLC 指纹图谱

小青龙汤方出自张仲景《伤寒论》，其组成为麻黄去节三两、芍药三两、细辛三两、干姜三两、甘草三两炙、桂枝去皮三两、半夏半升洗、五味子半升[1]。小青龙汤证“喘满”、“咳嗽”、“短气”、“微肿”属寒饮，故以寒饮为主症者，均可投之，尤在泾在《金匮翼》中称其“此散寒蠲饮之神剂”。中药单味药及药对的HPLC指纹图谱分析研究逐渐深入，本文从此角度出发分析小青龙汤组方特性，探讨中医方剂配伍科学内涵。

1 单味药HPLC指纹图谱研究

1.1 麻黄

麻黄为麻黄科植物草麻黄（Ephedra sinica Stapf）、中麻黄（Ephedra intermedia Schrenk&C.A.Mey.）或木贼麻黄（Ephedra equisetina Bunge）的干燥草质茎，其含有生物碱类、挥发油、有机酚酸、单萜糖苷类、木脂素类等化学成分[2]。木贼麻黄总生物碱含量最高（2.708%±0.642%），草麻黄其次（1.365%±0.624%），中麻黄最少（1.537%±0.746%）[3]，其中5种麻黄生物碱-去甲基伪麻黄碱、去甲基麻黄碱、麻黄碱、伪麻黄碱和甲基麻黄碱为麻黄单味药或麻黄与他药配伍时HPLC指纹图谱中的代表性成分。

1.2 芍药

白芍为毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根，赤芍为毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall.）或川赤芍（Paeonia veitchii Lynch）的干燥根[4]。白芍偏于补虚，功效为平抑肝阳、养血收阴；而赤芍偏于祛邪，功效为清热凉血、散瘀止痛，两者功效各有偏重。从化学成分组成上看，赤芍与白芍均含单萜苷类、多元醇类及挥发油类成分，但仍有各自的特征。余捷婧等[4]发现赤芍和白芍中单萜苷类化合物区别最大的是芍药内酯苷含量，白芍样品中芍药内酯苷量均值是赤芍样品量均值的6倍以上，而赤芍中没食子酸、没食子酸甲酯和1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖的含量明显高于白芍。另外，白芍与赤芍主成分分析结果显示白芍药材中的代表性成分为芍药苷，氧化芍药苷，五没食子酰葡萄糖，芍药内酯苷以及1个未知峰，其色谱峰对应5个因子的特征值大于1，累积贡献率达86.15%，而赤芍药材中的代表性成分为芍药苷，五没食子酰葡萄糖，芍药内酯苷和2个未知峰，其色谱峰对应5个因子的特征值均大于1，累积贡献率达78.39%，提示两者的代表性成分也存在明显的不同[5]。

1.3 细辛

细辛为马兜铃科植物北细辛Asarum heterotropoides f.mandshuricum（Maxim.）Kitag.、汉城细辛Asarum sieboldii Miq.Var.seoulense Nakai或华细辛Asarum sieboldii Miq.的干燥根和根茎。细辛中含有的甲基丁香酚具镇咳祛痰、镇痛等作用、细辛脂素具抗病毒和抗菌作用、但也含有具较强肾毒性的马兜铃酸以及具致癌作用的黄樟醚。细辛可碱制、醋制、米泔水制、碱醋制、甘草制、酒制、姜制、盐制、蜜制、炒制等。王元清等[6]通过对细辛10种不同炮制品的指纹图谱进行分析，发现醋制、甘草制与碱醋制能较好的保留有效成分甲基丁香酚与细辛脂素，酒制可增加甲基丁香酚、细辛脂素的浸出量，尤其甲基丁香酚的浸出量可增加10%-20%，但炮制后马兜铃酸A和黄樟醚都有不同程度的降低。而姜制的样品由于生姜中含有的姜烯、姜醇、樟烯等挥发油成分与姜辣素、蜜制可能由于蜂蜜中含有果糖、葡萄糖、氨基酸、有机酸等化学成分在炮制过程中影响细辛化学成分的转化与转变；炒制的样品可能由于炒制加快细辛中化学成分的转化与挥发油成分的散失，从而导致与其他样品相比相似度较低。

1.4 干姜

干姜为姜科植物姜（Zingiber officinale Roscoe）的干燥根茎，其主要成分为挥发油和无挥发性的特征性化学成分姜辣素类化合物（以6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚和10-姜酚为代表）。对比姜的不同炮制品干姜与姜炭发现，干姜辛燥之性较强，而姜炭辛燥之性弱且具有止血的功效。薛丹丹等[7]研究发现受热时6-姜酚分解、含量减少，而6-姜烯酚含量升高，干姜与姜炭功效的改变可能与6-姜酚和6-姜烯酚这两种成分之间的的转变有关，但具体有效物质仍有待于进一步研究。

1.5 甘草

甘草为豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根和根茎，其主要化学成分包括黄酮类、三萜类、多糖类和生物碱类。谢佳颖等[8]根据对照品的色谱保留时间对甘草色谱峰进行分析，发现包括芹糖甘草苷、甘草苷、异甘草素葡萄糖芹菜苷、异甘草苷在内的甘草总苷以及甘草酸为甘草的特征峰。当甘草与不同中药配伍后，可以影响对方及自身特征峰水平，进而影响疗效的发挥[9]。

1.6 桂枝

桂枝为樟科樟属植物肉桂Cinnamomum cassia（L.）J.Presl的干燥嫩枝，其含较高的挥发油，化学成分包括肉桂酸、桂皮醛、桂皮醇、香豆素、原儿茶酸、原儿茶醛，酚类、有机酸、多糖及苷类等。刘威等[10]研究不同产地或同一产地不同批次桂枝水提液HPLC指纹图谱发现，可以指认出包括桂皮醛、原儿茶酸、原儿茶醛、香豆素、肉桂醇和肉桂酸在内的6个色谱峰，其中桂皮醛为桂枝含量测定指标性成分，其色谱峰较大且稳定性、重现性良好，但受药材质量、采收时节、储存、运输等因素影响，6个化学成分含量差异显著。

1.7 半夏

半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥块茎，其主要成分包括核苷类、生物碱类、有机酸类、氨基酸、多糖及挥发油等，目前报道核苷类、生物碱类和有机酸类与其功效“燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结”相关。王甫成等[11]研究发现来源5个不同产地半夏的HPLC图谱，均在7.96 min处出现《中华人民共和国药典》规定的半夏指标性成分琥珀酸的特征峰[12]，还出现10个共有特征峰，其中有8个比较容易辨识，可作为半夏鉴别的特征峰。杨冰月等[13]对半夏药材不同提取部位-水、75%乙醇及95%乙醇的HPLC特征指纹图谱进行考察，其指纹图谱共有峰分别为12，13和16个，表明提取溶剂极性降低而溶出化学成分增加，另外还指认了5个特征峰分别为肌苷、鸟苷、腺苷、琥珀酸和盐酸麻黄碱，提示不同提取溶剂对药物溶出成分产生不同影响，同时也会影响药效。

1.8 五味子

五味子是木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实[14]，其主要化学成分为木脂素[15]，另外还含有多糖、挥发油、有机酸、三萜、甾醇、香豆素、内酯、生物碱类、黄酮类、强心苷类等多种化学成分，具收敛固涩、益气生津的功效。王连芝等[16]对不同产地五味子供试品的指纹图谱进行分析，从29个共有指纹峰中确认五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素6个主要的木脂素指纹峰。

2 药对HPLC指纹图谱研究

2.1 麻黄-甘草药对

《伤寒论》及《金匮要略》中应用麻黄-甘草药对的方剂较多（如麻黄甘草汤、小青龙汤等），麻黄与甘草配比不同，水煎液中成分含量会有不同程度的改变，而这势必会影响中药复方的药效。麻黄-甘草配伍，麻黄类生物碱的含量随着甘草配比量的增加出现不同程度地降低。徐文杰等[17]研究发现麻黄-甘草在共煎时，随着甘草的配伍比例增大，5种麻黄生物碱的含量较麻黄单煎液均有不同程度的降低，其中麻黄甘草（12∶3）组去甲基伪麻黄碱、去甲基麻黄碱、麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱含量最高，麻黄甘草（12∶6）组次之，麻黄甘草（12∶12）组最低，而这与“麻黄甘草汤，麻黄之开泄，得甘草以监之”相吻合。

麻黄与甘草共煎，不仅麻黄类生物碱的含量随着甘草配比量的增加出现不同程度地降低，而且水煎液中甘草苷、甘草酸的含量随着麻黄配伍比例的减少也发生改变。将不同配比麻黄甘草水煎液与相应的甘草单煎液进行HPLC分析，结果发现[17]麻黄甘草水煎液中甘草苷、甘草酸的含量随麻黄配伍比例的减少，均有不同程度的降低。小青龙汤原方麻黄甘草配比为1∶1，现方剂学中两者比例为9∶6，据此分析现方剂学中其作用应较原方增强。

2.2 麻黄-桂枝药对

《伤寒论》中麻黄与桂枝的比例不同、作用不同，如麻黄汤中麻黄用量大于桂枝，主发汗解表；桂枝去芍药加麻黄细辛附子汤中麻黄用量小于桂枝，主温胃化饮；小青龙汤中麻黄与桂枝剂量相等，主治表里兼证，在表是太阳伤寒证，在里是寒饮郁肺证。徐文杰等[18]取桂枝单煎液、麻黄-桂枝不同配比水煎液以及麻黄汤水煎液的供试品溶液进行HPLC分析，计算香豆素、桂皮醇和桂皮醛的含量，结果发现麻黄与桂枝配伍后，水煎液中5种麻黄生物碱的含量随着桂枝的比例增加，与桂枝单煎液相比均有不同程度的降低，下降幅度在15%-42%；香豆素、桂皮醇、桂皮醛的含量也呈不同程度的降低，下降幅度在16%-57%，与《伤寒杂病论》中麻黄与桂枝的比例不同、作用不同有共通之处。

2.3 白芍-桂枝药对

桂枝、白芍药对始见于张仲景的《伤寒论》，两者配伍，既有收调营卫、和气血，又有启发心阳、益阴止汗之功。不同配比桂枝、白芍药对的指纹图谱中出现相应的特征性成分峰，包括没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、肉桂酸、香豆素等，但峰高比例不尽相同。研究发现[19]选择肉桂酸和芍药苷作为特征峰，小青龙汤《伤寒论》中芍药三两（9 g）、桂枝去皮三两（9 g）两者配比为1∶1时，指纹图谱中肉桂酸和芍药苷峰高比为7。

2.4 白芍-甘草药对

芍药甘草汤系东汉张仲景《伤寒论·太阳篇》的著名方剂，是常用的缓急止痛之方，由白芍和炙甘草等组成，方中白芍与炙甘草配伍比例为1∶1，主营阴不足、肝脾不和，症见脘腹诸痛、四肢挛急等证候。芍药甘草汤的主要药理活性成分为白芍中的芍药苷和苯甲酰芍药苷，以及甘草中的甘草苷和甘草酸[9]。白芍与炙甘草不同配比对主要药理活性成分溶出率影响的研究发现除芍药甘草配比0.6∶1组中苯甲酰芍药苷溶出率较低外，0.6∶1、1∶1、3∶1这3个芍药甘草配伍比例中芍药苷、甘草苷和甘草酸的溶出率均高于其他比例组，其中3∶1配比相对更优[20]。

2.5 五味子-细辛药对

五味子与细辛药对，源于《伤寒论》中主治外感风寒，内有寒饮之咳喘恶寒、吐痰清稀的小青龙汤，以及《金匾要略》中主治寒饮咳嗽，痰稀胸满川的荃甘五味姜辛汤。五味子与细辛药对适用于寒饮伏肺之哮喘病，属于止咳平喘类、散敛相反药对。吴建兵等[21]研究发现五味子挥发油和细辛挥发油为五味子-细辛药对的平喘活性部位，而五味子挥发油、五味子水提液、五味子总酸和细辛挥发油为其镇咳及祛痰活性部位。

3 展望

对单味中药以及麻黄-甘草药对、麻黄-桂枝药对、白芍-桂枝药对、白芍-甘草药对、五味子-细辛药对进行HPLC指纹图谱的分析研究，可以帮助人们更好的认识每味中药的特性，了解中药不同植物来源、不同产地、不同炮制方法对其化学成分含量存在差异的影响，并且通过药对配伍比例的进一步研究可明了中药配伍后各中药成分含量的变化，以便解释药对不同配伍比例对临床疗效的影响。

但也需注意中药单味药以及药对HPLC指纹图谱研究中存在一些差异，包括供试品制备方法存在超声一步法[1，22]和超声两步法[13]的不同、供试品处理所需溶剂不同（包括甲醇[23]、蒸馏水[11]及70%乙醇[19]等）、不同溶剂处理后供试品HPLC指纹不同等，因此，是否应该在研究多样化的基础上，建立统一的针对方剂中单味药或药对HPLC指纹图谱分析研究的规范化流程值得进一步商榷。总之，虽然单味药以及药对HPLC指纹图谱研究方案存在差异，但对单味药以及药对HPLC指纹图谱的深入研究与分析，必将有助于更好的理解 小青龙汤的组方特性及探讨其配伍科学内涵。

1 宋秋杰.方剂辨证论治方法体系之建立.哈尔滨：黑龙江中医药大学硕士论文,2008.

2 郑孟凯,唐映红,陈建真,等.基于HPLC指纹图谱及主成分分析、聚类分析研究不同地区市售麻黄药材的质量差异.中华中医药志,2016,31(4):1420-1426.

3 Hong H,Chen H B,Yang D H,et al.Comparison of contents of five ephedrine alkaloids in three official origins of Ephedra Herb in China by high-performance liquid chromatography.J Nat Med,2011,65(3-4):623-628.

4 余捷婧,吴金雄,梁亚凤,等.HPLC同时测定赤芍和白芍中没食子酸等6种成分的量.中草药,2015,46(11):1673-1677.

5 章丽.基于“品种-ITS2序列-成分-药效”关联性探究丹皮、赤芍、白芍功效差异的科学内涵.镇江：江苏大学硕士学位论文,2016.

6王元清,江星明,王智,等.细辛炮制品HPLC指纹图谱定性与有效成分定量分析研究.中药材,2015,38(7):1388-1392.

7 薛丹丹,张科卫,钱琎.干姜、姜皮和姜炭的HPLC指纹图谱比较.中国实验方剂学杂志,2015,21(5):57-60.

8 谢佳颖,杨立国,夏伟军,等.甘草药材HPLC指纹图谱研究.云南中医学院学报,2015,38(5):32-36.

9 杨燕云,陈连庚,许亮,等.白芍甘草药对对芹糖异甘草和异甘草苷在大鼠体内药代动力学研究.辽宁中医药大学学报,2014,16(7):26-29.

10刘威,李家春,胡军华,等.桂枝水提液全时段双波长融合高效液相色谱指纹图谱研究及6个成分定量分析.药物分析杂志,2014,34(6):1043-1048.

11王甫成,孟祥松,蒋磊,等.HPLC指纹图谱法鉴别半夏及其伪品.辽宁中医药大学学报,2016,18(4):56-58.

12中国药典委员会.中华人民共和国药典.北京：中国医药科技出版社,2015:119.

13杨冰月,李敏,施佳,等.半夏及其炮制品姜半夏HPLC特征指纹图谱系统性研究.中草药,2014,45(5):652-658.

14牟倩倩,贺敬霞,严敏嘉,等.五味子木脂素类制剂新技术与新剂型研究进展.亚太传统医药,2016,12(24):49-53.

15苏联麟,李平,程雪,等.基于UPLC-Q/TOF-MS的醋制五味子对酒精性肝损伤大鼠胆汁代谢物的影响研究.中草药,2017,48(1):114-120.

16王连芝,付克,顾媛媛,等.不同产地五味子药材色谱图谱研究.中国中医药信息杂志,2016,23(11):103-106.

17徐文杰,赵杰,周慧芳,等.不同配伍配比对麻黄甘草药对有效成分含量及抗炎活性的影响.四川中医,2012,30(10):50-53.

18徐文杰,陈飞龙,谢颖,等.不同配伍配比对麻黄-桂枝药对有效成分含量的影响.中国实验方剂学杂志,2012,18(10):84-88.

19闫玉军.桂枝、白芍药对不同比例配伍提取物指纹图谱研究.辽宁中医药大学学报,2014,16(12):58-60.

20李妍,杨燕云,张振秋,等.白芍-甘草药对不同配伍比例提取物中有效成分溶出规律的研究.中草药,2012,44(3):291-295.

21吴建兵,褚襄萍,张永煜,等.五味子-细辛药对抗哮喘活性部位筛选.中华中医药学刊,2013,31(1):121-123.

22许宏亮,常建平,梁宗锁,等.半夏皮与块茎中4类成分的比较.中成药,2016,38(9):1998-2002.

23徐佳琪,谢瑞芳,唐志鹏,等.基于综合评分法的干姜药材HPLC指纹图谱分析.中国临床药学杂志,2015,24(2):99-103.

（责任编辑：陈 宁，责任译审：王 晶）

Discussion on Character of Xiaoqinglong Decoction Based on HPLC Fingerprints of Single Herb and Herb-pair

Zhang Yuping,Wang Qingqing,Deng Xiulan,Zhang Xiaojing,Zhong Xianggen
(School of Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Xiaoqinglong decoction,first recorded by Zhang Zhongjing in traditional Chinese medicine(TCM)classic text Shang Han Lun(Treatise on Cold Damage Diseases),has eight herbal components including Herb Ephedrae(Mahuang),Radix Paeoniae Alba(Shaoyao),Radix Asari(Xixin),Rhizoma Zingiberis(Ganjiang),Glycyrrhiza Uralensis(Gancao),Ramulus Cinnamomi(Guizhi),Rhizoma Pinelliae(Banxia)and Fructus Schisandrae(Wuweizi).Fingerprints of HPLC for single herb and herb-pair including Mahuang-Gancao,Mahuang-Guizhi,Shaoyao-Guizhi,Shaoyao-Gancao,Wuweizi-Xixin were analyzed.Based on the HPLC of single herb and herbal pair,we discussed the character of the Xiaoqinglong decoction and explored the scientific connotation of the compatibility of medicines in prescription.

Xiaoqinglong decoction,single herb,herb-pair,HPLC,fingerprints

10.11842/wst.2017.07.023

R917

A

2017-04-19

修回日期：2017-05-18

＊ 国家自然科学基金委青年基金项目（81403313）：基于IL-13/STAT6与纤毛自噬介导气道粘液增多探讨小青龙汤温肺蠲饮治疗哮喘发作机制研究，负责人：王青青。

＊＊ 通讯作者：王青青，副教授，硕士生导师，主要研究方向：免疫药理学及中药新药研发。