高效液相法同时测定银杏叶中11种成分的含量

吕金丽+杨彪+李孟璇+孟兆青+马世平+王振中+丁岗+黄文哲+萧伟

[摘要]为了考察不同产地银杏叶药材中黄酮醇苷和双黄酮的含量差异，本实验采用Agilent ZORBAX SB- C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，在流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液系统，流速1 mL·min^-1，检测波长为254 nm的条件下进行梯度洗脱，建立了同时测定银杏叶中7种黄酮醇苷和4种双黄酮成分含量的高效液相色谱方法。测定结果表明10个不同产地的银杏叶药材中7种黄酮醇苷和4种双黄酮成分的含量存在差异。

[关键词] 银杏叶； 黄酮醇苷； 双黄酮； 高效液相法； 多成分定量

[Abstract] To study Ginkgo biloba leaves in different producing area， we establish an HPLC method for the simultaneously determination of seven flavonoids glycosides and four biflavonoids in G. biloba leaves. The analysis was performed on an Agilent ZORBAX SB-C18 column（4.6 mm×250 mm， 5 μm） wich acetonitrile， and 0.4% phosphoric acid as mobile phase at flow rate of 1 mL·min^-1 in a gradient edution， and the detection was carried out at 254 nm.The calibration curves of the seven flavonoids glycosides and four biflavonoids had a good linearitiy with good recoveries. The established HPLC method is simple， rapid， accurate， reliable， and sensitive， and can be applied to the identification and quality control of G. biloba leaves.

[Key words] Ginkgo biloba leaves； flavonoid glycosides； bisflavonoids； high performance liquid chromatography； multi components determination

银杏叶为银杏科植物银杏Ginkgo biobal L.的干燥叶，化学成分包括黄酮醇苷、双黄酮、原花青素、银杏内酯、聚戊烯醇、有机酸等^[1-2]。其中黄酮醇苷类化合物具有改善血液循环，抑制血栓形成，保护神经细胞，改善心脑功能的作用^[3-4]。近年来对银杏叶中双黄酮的研究也日益增多，异银杏双黄酮具有体内外抑制大鼠血栓形成的作用^[5]，金松双黄酮能够增强紫杉醇对A54细胞的凋亡作用^[6]，银杏双黄酮具有抗卵巢腺癌细胞活性^[7]。可见黄酮醇苷和双黄酮类成分是银杏叶药材中有生物活性的重要组成成分，比较具有研究价值，对银杏叶药材的质量控制具有一定的意义。

近年来对银杏叶中黄酮和双黄酮类成分的含量测定多采用超高效液相法^[8-9]，高效液相法^[10]，固相萃取-高效液相色谱法^[11]，及超临界流体色谱法^[12]等，而同时测定银杏中10种黄酮苷类成分以上的文献报道较为少见。本实验在采用高效液相色谱技术的基础上，建立同时测定银杏叶中7种黄酮醇苷类和4种双黄酮含量的方法，对10个不同产地的银杏叶药材进行测定。结果表明，该方法精密度，稳定性，重复性，准确度良好，能够比较精确地全面反映银杏叶中黄酮醇苷类和双黄酮类成分的含量，為银杏叶药材的质量控制研究提供参考依据。

1 材料

Agilent 1100型高效液相色谱仪（四元梯度泵，自动进样器、柱温箱和DAD检测器，Agilent科技有限公司）；AL204型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Lichrospher C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm） 型色谱柱；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）

甲醇（分析纯）、磷酸（分析纯）购自南京化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）购自美国TEDIA公司；超纯水由Milli-Q超纯水系统制得。

银杏叶药材经江苏康缘药业现代中药研究所王振中教授鉴定为银杏科植物银杏G. biobal 的干燥叶，产地来源见表1。槲皮素-3-O-芸香糖苷（Ⅰ，批号15018），槲皮素-3-O-葡萄糖苷（Ⅱ，批号150312），异鼠李素-3-O-葡萄糖苷（Ⅲ，批号140622），异鼠李素-3-O-芸香糖苷（Ⅳ，批号150126），山柰酚-3-O-葡萄糖苷（Ⅴ，批号140524），山柰酚-3-O-芸香糖苷（Ⅵ，批号141024），山柰酚-3-O-葡萄糖-2′，6′-二鼠李糖苷（Ⅶ，批号150918），去甲银杏双黄酮（Ⅷ，批号150417），银杏双黄酮（Ⅸ，批号150417），异银杏双黄酮（Ⅹ，批号141216），金松双黄酮（Ⅺ，批号150520）以上对照品购自成都普菲德生物技术有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C₁₈色谱柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.4%磷酸（B）；梯度洗脱0～20 min，10～18%（A）；20～50 min，18%（A）；50～60 min，18%～26%（A）；60～80 min，26%～55%（A）；80～95 min，55～100%（A）；95～100 min，100%（A）。流速1 mL·min^-1；检测波长为254 nm；柱温30 ℃，进样量10 μL。

分别取对照品溶液和供试品溶液各10 μL注入色谱仪，按上述色谱条件，记录色谱图，见图1。各色谱峰与相邻峰之间的分离度均大于1.5，理论塔板数均不低于5 000，说明方法适用于同时测定银杏叶中的11种成分。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取槲皮素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖-2′，6′-二鼠李糖苷、去甲银杏双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、金松双黄酮11种对照品，加甲醇制成含相对应对照品质量浓度为0.010 5，0.053 0，0.015 5，0.090 0，0.050 0，0.101 5，0.106 0，0.150 0，0.110 0，0.110 0，0.120 0 g·L^-1的储备液，4 ℃冰箱放置，备用。

2.3 供试品溶液的制备 将银杏叶粉碎过40目筛，精密称取银杏叶药材1.000 g，精密加入体积分数75%甲醇100 mL，称重，置水浴中加热回流提取40 min，取出，放冷，再称重，用体积分数75%甲醇补足失重，摇匀后过滤，精密量取滤液50 mL，蒸干，残渣用甲醇溶解，定容至10 mL量瓶中，溶液经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察 分别精密吸取1 mL对照品储备液，分别置于2，5，10，25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，吸取上述不同浓度的混合对照品溶液及对照品初始混合溶液各10 μL，分别进样测定，以峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X）为横坐标，计算回归方程，见表2，结果表明在该范围内各对照品线性关系良好。

2.5 精密度试验 取混合对照品溶液10 μL，连续重复进样6次，记录峰面积，计算6次峰面积的相对标准偏（relative standard deviation，RSD），结果显示，槲皮素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖-2′，6′-二鼠李糖苷、去甲银杏双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、金松双黄酮11种对照品RSD均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取四川成都产地的银杏叶供试品溶液，分别于0，4，8，12，24 h按2.1项下色谱条件测定，记录峰面积，计算结果得槲皮素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖-2′，6′-二鼠李糖苷、去甲银杏双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、金松双黄酮峰面积的RSD分别为0.37%，0.62%，0.85%，0.65%，0.73%，0.45%，1.6%，0.29%，0.31%，0.34%，0.28%，相对标准偏差（RSD）均小于2.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验 取四川成都产地的银杏叶供试品溶液，平行制备6份，按2.1项下色谱条件测定。结果计算得槲皮素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖-2′，6′-二鼠李糖苷、去甲银杏双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、金松双黄酮平均量分别为0.662 4，0.082 8，0.103 4，0.522 1，0.130 5，0.644 6，0.791 1，0.641 9，0.898 0，0.853 3，0.943 7 mg·g^-1，其RSD分别为0.89%，1.05%，0.93%，0.74%，1.66%，0.83%，0.69%，0.55%，0.53%，0.49%，均小于2%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取四川成都产地的银杏叶供试品溶液，分别精密加入上述混合对照品溶液（与样品中各待测成分的量相当），按2.2項下方法制备供试品溶液，平行6份，按照2.1项色谱条件测定，计算回收率，结果槲皮素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖-2′，6′-二鼠李糖苷、去甲银杏双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、金松双黄酮平均回收率分别为101.1%，100.3%，100.7%，101.3%，100.1%，100.0%，99.42%，101.9%，101.3%，100.3%，100.6%，RSD分别为0.34%，0.34%，0.81%，0.68%，0.58%，0.11%，0.88%，1.5%，0.38%，0.89%，1.1%，RSD均小于2%，结果表明本方法同时测定7种黄酮醇苷类和4种双黄酮类成分的含量回收率结果良好。

2.9 样品含量测定 按2.3项下制备的供试品溶液，按2.1项色谱条件测定，每份供试品溶液分别平行测3次。用线性回归方程计算10个产地银杏叶药材中11种化合物的含量，计算出平均值及相应的RSD，见表3。各个产地不同化学成分的含量分布，见图2。

3 讨论

实验过程中考察了不同提取方法和提取时间对样品提取率的影响。比较了超声和回流提取的结果，发现回流提取40 min时，提取效果较好。色谱条件中采用二极管阵列检测器对待测成分进行全波长扫描，同时考虑各组分的检测信号强度和检测灵敏度，选择254 nm作为检测波长。

从表3及图2结果中可以看出，无论是10种成分的含量总和还是各指标成分分别比较，不同产地的银杏叶存在差异，其中槲皮素-3-O-葡萄糖的RSD为49.07%可知地区间含量差异较大，而从图2中可以看出产于山东郯城和辽宁锦州的银杏叶中11种成分的总含量相对于其他产地较高，其中辽宁锦州产地的银杏叶药材中槲皮素-3-O-芸香糖苷含量比较高，而山东郯城银杏叶中金松双黄酮含量较高。不同产地银杏叶中含量的差异可能与环境，采集及处理方法有一定的关系，本实验未对相关影响因素进行考察，后续可针对上述因素进行相关更深入研究。

本实验采用高效液相建立的方法实现了同时测定黄酮醇苷和双黄酮两大类成分，可以较为全面的反映药材中黄酮类成分信息，多指标成分定量的作用。该方法为银杏叶药材及其制剂的质量控制，准确全面地评价其内在品质提供了有力的技术依据。

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[责任编辑 丁广治]