酶生物燃料电池自供能传感器的研究现状及应用

宋荣斌， 朱俊杰

(生命分析化学国家重点实验室，南京大学化学化工学院，江苏南京 210023)

1 前言

生物传感器是由分子识别元件与信号转换元件构成的分析检测器件，已经成功应用于环境监测、疾病诊断、食品安全和军事等领域[1 - 2]。目前，对于生物传感器不仅要求准确、可靠、灵敏的检测目标物，还逐步倾向于能够快速便捷式的现场检测[3 - 5]。目前绝大多数的生物传感器离不开外加能源，这大大制约了其发展和广泛应用[6]。酶型生物燃料电池(BFC)是一类以生物酶为催化剂，直接将燃料中的化学能转化为电能的装置。在酶的催化作用下，糖类、醇类或胺类等燃料在阳极发生氧化反应产生电子，这些电子流经外部负载到达阴极，在阴极上经酶的催化作用被氧化性物质(氧气)接受，产生电流[7 - 9]。酶生物燃料电池的反应条件温和(常温、常压、中性pH)，燃料来源广泛并在自然条件下可再生，生物催化剂和燃料的生物相容性好，能够避免对目标分析物造成损伤；同时，它还具有能量转化效率高、装置易微型化等优点[10 - 12]。因此，酶生物燃料电池给生物传感器的发展带来了新机遇。

基于酶生物燃料电池的自供能生物传感器其基本的检测思路是将目标分析物的浓度转换为生物燃料电池的电压、电流和功率变化[13 - 15]。它与传统生物传感器相比优势在于：(1)无需外部电源，只需用电压电流表这样的简单手段测量BFC本身的输出信号，从而便于实现快速的现场实时监测[16]。(2)无需三电极体系，电化学传感发生在微生物燃料电池本身的阴阳两极，更利于微型化。另外，也无需参比电极，自供能传感器的工作稳定性好[15,17]。(3)生物燃料电池的自供能生物传感器的测试过程未引入外加电源，可有效防止体系中其它电化学活性物质在电极表面发生氧化还原反应所带来的干扰[18]。从目前酶生物燃料电池自供能传感器的相关报道来看，这类传感器的基本工作原理主要有底物效应、酶活抑制效应、酶负载量变化和位阻效应四大类。本文以此为分类，就近五年内酶生物燃料电池自供能传感器的发展进行详细的论述。

2 酶生物燃料电池自供能传感器研究现状及应用

2.1 底物效应

酶生物燃料电池的输出性能与燃料的浓度呈现依赖关系。由于它所使用的燃料为两极固定的酶对应的底物，因此可以通过电池性能参数的变化来反映生物底物浓度的变化。借助这一构建思路，研究人员发展了多种基于底物效应的酶生物燃料电池自供能生物传感器。其中，以检测葡萄糖的酶生物燃料电池自供能传感器最为常见。2001年，Katz等[19]最早将葡萄糖氧化酶(GOD)的活性中心黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，以及葡萄糖脱氢酶(GDH)的活性中心烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)固定到阳极上，将细胞色素C氧化酶固定到阴极上，构建了葡萄糖/氧气EBFC。该电池的开路电位与葡萄糖浓度存在依赖性关系，可用作检测葡萄糖的自供能传感器。这一研究开创了酶生物燃料电池检测葡萄糖的先河。在此工作的基础上，Seokheum等[20]利用打印技术，在纸上发展了自供能式葡萄糖传感器，大大的提高了传感器的便捷性。另外，不同于前期工作，这项工作中酶生物燃料电池采用的是镍基空气阴极，避免了使用酶，进一步降低了传感器的成本，进而提高了其实用性。作为自供能传感器的能量供给和信号响应元件，高效、稳定的生物燃料电池是构建灵敏度高、检测范围宽的传感器的基础。因此，Zhang等[21]将光电技术引入到了自供能式葡萄糖传感器。他们利用氢氧化镍/硫化镉/二氧化钛光电阳极和血红素/石墨烯修饰的阴极组建光燃料电池。研究表明，在光照的条件下，葡萄糖的氧化得到进一步促进，因此构建的光燃料电池的性能有很大提升，开路电压达到了1.21 V。受益于这一优良的性能，构建的葡萄糖传感器的线性检测范围为10～500 μmol/L，检测限低至5.3 μmol/L。这项工作的成功开展将对在酶生物燃料电池自供能传感器中获得多重能量转移带来启发，有望获得超灵敏的自供能式传感器。

通过对酶的选择和替换，可以发展用于检测其它底物的自供能式传感器。Minteer等[22]将乳酸氧化酶用作阳极生物催化剂构建酶生物燃料电池。同样地，基于电池输出电流与底物乳酸浓度之间的依赖关系，开发的酶生物燃料电池可以用于分析检测乳酸。随后，Wang等[23]借助丝网印刷技术在具有高度伸缩性的纺织物上构建了乳酸自供能式传感器。这一传感器可以抵抗严重的形变，即使在100次拉伸后，性能也未受影响。因此，该团队将其直接构建在袜子上用于直接分析人体汗液中的乳酸含量。很显然，该工作有助于推动可穿戴式自供能传感器的发展。另外，在酶生物燃料电池阴极，氧气作为电子受体，它的浓度也直接影响到电池的性能。因此，基于电池输出性能和氧气中的依赖关系，也可以发展检测氧气的自供能式传感器[24]。上述工作都是发展分析酶直接底物的自供能式传感器，对它们的工作原理进一步深入，即可以开发底物氧化产物的传感器。Dong等[25]利用乙醇脱氢酶(ADH)和胆红素氧化酶(BOD)分别作为阳极和阴极生物催化剂，发展了可用于检测乙醛的自供能传感器。在这一工作中，燃料是乙醇，ADH催化氧化乙醇产生乙醛并获得电子。当存在目标物乙醛时，阳极的催化反应平衡向左侧移动，产生的电子减少，酶生物燃料电池性能降低。因此，酶生物燃料电池的性能与乙醛之间也存在着某种依赖关系，可用于定量分析乙醛。这为拓宽基于底物效应的酶生物燃料电池自供能传感器的检测范围提供了新思路。

2.2 酶活抑制效应

在酶生物燃料电池中，生物催化剂酶的活性必然会影响电池的性能。当检测的目标物影响酶的活性时，会引发酶生物燃料电池各性能参数的变化，这些参数的变化程度就可以反映出目标物的浓度，进而可以发展基于酶活抑制效应的酶生物燃料电池自供能传感器。早在2011年，Dong等[26]基于Hg2+对乙醇脱氢酶和胆红素氧化酶活性的抑制作用，发展了Hg2+的酶生物燃料电池自供能传感器，并将其用于分析实际水样(自来水、地下水和湖水等)中Hg2+的含量。结果表明，该传感器具有优良的选择性，其它15中常见金属离子均无干扰；线性检测范围为1～500 nmol/L，检测限为1 nmol/L，远低于其它报道的方法。除了胆红素氧化酶外，漆酶也是酶生物燃料电池中常用的阴极酶。Minteer等[27]发现亚砷酸盐和砷酸盐均对漆酶的活性表现出抑制作用。基于这一原理，该课题组将葡萄糖氧化酶和漆酶分别用作酶生物燃料电池的阳极和阴极生物催化剂，发展了亚砷酸和砷酸盐的自供能传感器。同样地，基于全氟辛烷磺酰基化合物对谷氨酸脱氢酶活性的抑制作用，Xie等[28]开发了用于检测这种有机污染物的酶生物燃料电池自供能传感器。上述工作中，目标物所引起的电池性能的变化只需万用表即可测定，这为环境污染领域的便捷式、现场检测提供了新策略。

除了直接检测酶的抑制剂外，酶生物燃料电池自供能传感器还被用于分析酶抑制剂的掩蔽剂。Liu等[29]利用葡萄糖氧化酶和漆酶分别作为阳极和阴极的生物催化剂构建酶生物燃料电池，并用作L-半胱氨酸的自供能式检测。在该工作中，Cu2+会与葡萄糖氧化酶活性中心还原态的辅酶FADH2形成络合作用，从而抑制酶的活性，进而获得较低的输出性能。而当加入L-半胱氨酸后，通过Cu-S键的作用大量的Cu2+会与L-半胱氨酸结合，即酶重新被激活，电池的输出性能重新恢复，性能恢复的程度与L-半胱氨酸的浓度呈依赖关系。相似的原理也被用于开发EDTA的酶生物燃料电池自供能传感器[30]。不同于酶抑制剂的检测报道，这两项检测掩蔽剂的传感器属于“signal-on”模式，因此可以避免假阳性信号的出现，能够更准确的反应检测物的实际浓度变化。另外，同一种酶抑制剂对应的掩蔽剂种类往往很多，通过合理的设计，可以进一步拓宽自供能传感器可检测的范围。

2.3 酶负载量变化

酶生物燃料电池电极上酶负载量的变化势必会影响电池的性能。通过合理的设计，使得分析物浓度与电极上酶的负载量存在依赖关系，从而表现出电池性能的变化，这些变化反过来反映了目标分析物的浓度。借助这一理念，并结合免疫技术，Ge等[31]制备了一种用于检测肿瘤标志物的纸质自供能传感器。在该工作中，电极阳极修饰上抗体1用于捕获癌胚抗原，同时将抗体2与葡萄糖脱氢酶一同修饰在多壁碳纳米管上。当存在癌胚抗原时，抗体1、抗原及抗体2之间形成夹心结构，因而葡萄糖脱氢酶也同时固定到阳极表面。因此，电池的输出电流与癌胚抗原的浓度之间存在依赖性关系。相似的报道也见于Guo等[32]的工作，该传感器的检测限低至0.2 nmol/L，灵敏度比传统的ELISA法提高了50倍。DNA互补技术也被用于酶生物燃料电池自供能传感器领域。Yu等[33]在酶生物燃料电池的阳极修饰上与目标DNA部分互补的DNA1，同时将葡萄糖氧化酶装载到多孔金内，并在多孔金表面通过Au-S键修饰上与目标DNA部分互补的DNA2。当溶液中存在目标DNA时，基于DNA双链互补技术，葡萄糖氧化酶被固定到阳极上。同样电池的性能提高程度与目标DNA的浓度呈现依赖关系。另外，该工作中还引入了超级电容器用于存储酶生物燃料电池产生的电能。这些产生的电能被大量累计，并被瞬间释放，因此整个体系可以获得更大的电流，进而可以提高传感器的灵敏度，为检测DNA错配提供了新途径。

在上述工作的基础上，我们课题组[34]基于免疫竞争法构建了用于检测肿瘤细胞的酶自供能传感器。在该工作中，阳极修饰上能够捕获肿瘤细胞的适配体，该适配体同时也是一段DNA序列。因此我们将与其部分互补的DNA序列和胆红素氧化酶一同修饰在DNA上。基于DNA互补技术，阳极表面固定上大量的胆红素氧化酶。当存在肿瘤细胞时，发生免疫竞争反应，肿瘤细胞与阳极的适配体结合，同时互补的双链DNA被打破，胆红素氧化酶从阳极脱离，电池输出性能的降低程度与肿瘤细胞的浓度存在依赖关系。这项工作相当于在前面的工作原理上更进了一步，目标物的作用不再是辅助生物催化剂的固定，而是促进生物催化剂从电极表面的脱离。研究结果表明，该传感器的检测限为2个细胞，有望成为临床肿瘤早期诊断的有力工具。最近，分子印迹技术也被用于酶生物燃料电池自供能传感器。Liu等[35]在酶燃料电池的阴极构建了硼酸盐亲和性的分子印迹聚合物，当目标物糖蛋白存在时，分子印迹聚合物识别目标物，并且通过亲和作用固定上硼酸亲和基团功能化的碳纳米管/胆红素氧化酶。因此，酶生物燃料电池性能的提高反映了不同浓度的目标物。开发的自供能传感器可以用于直接分析血清样品，表现出了很好的临床实用性。

2.4 位阻效应

酶生物燃料电池的性能容易受到电极与酶之间电子传递效率以及酶催化底物速率的影响。当不同浓度的目标物被捕获到电极上时，会对酶与底物的接触和电极与酶之间的电子传递产生不同的阻碍作用或是去阻碍作用，进而不同程度的影响电池的性能。基于这一原理，Yu等[36]发展了一种检测前列腺特异性抗原的自供能传感器。在该工作中，Cu2O用作阳极催化剂，胆红素氧化酶作为阴极催化剂。当阳极上固定的抗体与目标抗原蛋白结合后，抗原蛋白会充当绝缘层阻碍燃料与阳极催化剂的接触，进而使得酶生物燃料电池的性能降低。利用相似的原理，我们课题组[37]也开发了一种用于检测循环肿瘤细胞的工作。在电池的阴极修饰上肿瘤细胞的适配体，当目标细胞存在时，适配体捕获细胞，细胞固定到电极上。因此，基于位阻作用，电子受体K3[Fe(CN)6]与阴极的接触受到阻碍；同时，细胞带负电会静电排斥电子受体K3[Fe(CN)6]，电子受体与阴极的接触会被进一步削弱。该工作展现出了更高的灵敏度。另外，在加热的条件下(48 ℃)，被适配体捕获的细胞会重新从阴极表面脱落，因此该传感器可以重复使用。研究结果表明可重复使用9次，进一步提高了该传感器的实用性。

多目标分析是传感器的目标之一，Dong等[38]开发了一种基于位阻效应的自供能适配体逻辑门传感器。该工作构建了基于葡萄糖氧化酶/凝血酶适配体功能化的生物阳极和胆红素氧化酶/溶菌酶适配体功能化的生物阴极的无隔膜微流控芯片酶生物燃料电池。当只有凝血酶存在时即输入信号为(1,0)时，阳极的TBA层识别凝血酶，封闭电极界面，导致葡萄糖在电极表面发生氧化的过电位增加，因此(1,0)信号的输入降低了EBFC开路电压；反之，溶菌酶单独存在时，即输入信号为(0,1)时，会被阴极适配体捕获，导致氧气还原过电位的增加，电池性能降低。当两种目标物同时存在，即输入信号为(1,1)时，阴阳两极的适配体均捕获底物，电压的输出信号进一步降低，即此时的输出信号记为输出0。当没有底物输入时，电池的电压输出几乎不会受到影响记为输出1，这与逻辑门计算中的NAND逻辑门原理相似。因此，该传感器可以用于检测样品中两种目标物是否同时存在，但无法确定哪一种目标物存在，还需进一步提高。上述所有工作中，目标物都是起到阻碍作用，因此这些传感器都是“signal-off”的模式。在这些工作原理上再进一步，即可开发“signal-on”模式的自供能传感器。Li等[39]开发了一种检测氨苄青霉素的自供能传感器。在该工作中，酶生物燃料电池的阳极修饰上葡萄糖氧化酶和适配体1(也是一段DNA序列)；同时在二氧化硅/纳米金复合材料的表面修饰上适配体1的互补DNA序列。基于DNA互补技术，二氧化硅/纳米金复合材料固定到电极表面，充当绝缘层阻碍葡萄糖与酶的接触。当存在目标物时，由于免疫竞争反应，适配体1与目标物结合，同时二氧化硅/纳米金复合材料从电极表面脱落，位阻减小，电池的性能恢复。电池性能提高的程度即可以反应目标物的浓度,有望成为食品安全现场检测的有力手段。

3 结论和展望

酶生物燃料电池自供能传感器在推动传感器便捷化、微型化和低成本化等方面具有突出的优势，受到了广泛的关注。本综述从设计原理出发，详细的介绍了近五年酶生物燃料电池自供能传感器的研究状况和应用领域。目前，通过借助免疫技术、DNA技术、适配体技术、分子印迹技术等，酶生物燃料电池自供能传感器已经应用于酶、蛋白、细胞、生物标志物以及环境污染物的检测，大大简化了检测工序。同时，也仍然存在着一些问题，此类自供能传感器通常是体外检测，如何通过合理的设计实现原位检测，将有助于避免生物分子脱离人体所造成的关键信息缺失。另一方面，传感器识别元件只依赖于某一个电极，有效的同时利用双电极有望实现多目标物的分析和灵敏度的提高。此外，酶生物燃料电池较低的性能，也限制了此类自供能传感器的灵敏度和实际应用，研究者可通过开发结构更为合理的基底材料或引入其他能源(如太阳能)来完善这一问题。因此，原位、多目标、超灵敏检测将是未来酶生物燃料电池自供能传感器的重要研究方向之一。