骨髓间充质干细胞静注对碱烧伤兔角膜修复的促进作用及机制

孙红，乔丽萍，侯世科，赵少贞，孙惠敏，袁佳琴，韩泉洪

(1 天津医科大学眼科临床学院，天津市眼科医院，天津300020；2武警后勤学院附属医院；3天津医科大学眼科中心)

骨髓间充质干细胞静注对碱烧伤兔角膜修复的促进作用及机制

孙红1，乔丽萍2，侯世科2，赵少贞3，孙惠敏3，袁佳琴3，韩泉洪1

(1 天津医科大学眼科临床学院，天津市眼科医院，天津300020；2武警后勤学院附属医院；3天津医科大学眼科中心)

目的 观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)静注对碱烧伤兔角膜修复的促进作用并探讨其机制。方法 取新西兰大白兔60只，制备右眼角膜缘碱烧伤模型，随机分为观察组和对照组，各30只(30眼)。观察组耳缘静脉注射BMSCs细胞悬液3.47×106个/kg，对照组注射等体积PBS。注射后第3、21、60天，两组行右眼角膜透明度和角膜上皮再生状况评分，采用裂隙生物显微镜观察角膜血管新生情况，计算角膜新生血管面积。结果 第3、21、60天观察组角膜上皮再生程度评分均低于对照组(P均<0.05)。第3天两组角膜混浊程度评分比较差异无统计学意义(P>0.05)，第21、60天观察组均低于对照组(P均<0.05)。观察组第3、21天角膜新生血管面积大于对照组(P均<0.05)，第60天小于对照组(P均<0.05)。结论BMSCs静注可促进碱烧伤兔角膜的修复，提高角膜透明度；其机制可能与其早期促进损伤角膜新生血管生成、晚期抑制角膜新生血管生成有关。

角膜修复；碱烧伤；骨髓间充质干细胞；新生血管生成；兔

骨髓间充质干细胞(BMSCs)存在于骨髓中，是一种具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，亦是能分泌多种细胞因子的较原始骨髓基质细胞，具有基质细胞的特性。在适宜的培养条件下，BMSCs可增殖并被诱导分化为包括骨、软骨、肌肉、脂肪、神经等组织细胞，是组织工程良好的种子细胞[1～3]。BMSCs可取自自体骨髓，取材方便，由其诱导而来的组织在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥等问题，常作为组织工程的种子细胞用于修复组织缺损[4]；但其静脉应用对碱烧伤角膜修复作用的报道鲜见。为此，我们于2015年6月～2016年12月进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 新西兰大白兔60只，体质量(1.5±0.6)kg，月龄2个月，雌雄不分，健康无任何眼疾。兔BMSCs为我实验室自制。制备方法：取1 个月龄体重0.5～1.0 kg新西兰大白兔1 只, 肌注快速眠0.1 mL麻醉。无菌操作下穿刺股骨骨髓腔,抽出骨髓5～8 mL。DF12稀释后，直接接种于含有20 %胎牛血清的DF12 培养液中,于37 ℃、5 %CO2、饱和湿度下培养。每48 h更换一次培养液。收集第二代或第三代细胞备用。

1.2 角膜碱烧伤模型制备及分组处理 将60只兔麻醉后制备角膜碱烧伤模型[5]：将浸透1 mol/L氢氧化钠溶液的滤纸环片(内径8 mm，外径14 mm)置于兔右眼角膜缘上45 s，再用生理盐水冲洗5 min。结果显示，角膜碱烧伤程度均在Ⅲ级以上，造模成功。笼养24 h后用随机双盲法(编号，查表法)分为观察组和对照组，各30只(30眼)。 观察组麻醉后耳缘静脉注射BMSCs细胞悬液3.47×106个/kg。对照组经耳缘静脉静注等体积PBS。两组均用氟哌酸眼液滴眼，4次/d；结膜囊涂四环素眼膏，1次/晚。

1.3 相关指标观察 第3、21、60天两组各分别行空气栓塞处死10只兔，取完整角膜组织观察以下指标。

1.3.1 角膜上皮再生程度 角膜组织行荧光素钠染色，按角膜染色面积进行评分：角膜无着色为0分，染色面积≤1/4象限计1分，染色面积>1/4～≤1/2象限计2分，染色面积>1/2～≤3/4象限计3分，染色面积>3/4象限计4分。

1.3.2 角膜透明度 采用裂隙显微镜观察角膜透明度，角膜透明无混浊为0分，轻度混浊且虹膜纹理可见计1分，中度混浊且虹膜纹理不清计2分，重度混浊隐见瞳孔计3分，极重度混浊且瞳孔不见计4分。

1.3.3 角膜新生血管面积 计数自角巩缘长出、连续弯曲度小、朝向植入物最长血管(即新生血管)的长度和数量；计算其面积。角膜新生血管生长面积(mm2)=C/12×3.141 6[r2-(r-L)2]。C为发生新生血管的角膜圆周钟点数，r为角膜半径，L为血管长度。

2 结果

2.1 两组不同时间角膜上皮再生评分比较 观察组及对照组第3天角膜上皮再生评分分别为(2.9±0.45)、(3.5±0.56)分，第21天分别为(2.7±0.39)、(3.8±0.47)分，第60天分别为(2.1±0.43)、(3.9±0.51)分。观察组第3、21、60天均低于对照组(P均<0.05)。

2.2 两组不同时间角膜混浊程度评分比较 观察组及对照组第3天角膜混浊程度评分分别为(2.8±0.2)、(2.9±0.3)分，两组比较P>0.05；第21天分别为(2.7±0.4)、(3.1±0.2)分，第60天分别为(1.9±0.3)、(3.5±0.4)分；第21、60天均低于对照组(P均<0.05)。

2.3 两组不同时间角膜新生血管面积比较 观察组及对照组第3天角膜新生血管面积分别为(12.56±0.46)、(3.34±0.51)mm2，第21天分别为(19.16±0.76)、(14.56±0.46)mm2，第60天分别为(4.36±0.66)、(29.16±0.68)mm2。第3、21天观察组高于对照组(P均<0.05)，第60天低于对照组(P均<0.05)。

3 讨论

在角膜缘碱烧伤早期，如果建立良好的角膜缘血管网的血液供应，可为角膜修复提供充分的氧气和营养，阻断角膜发生进一步损伤。角膜缘化学损伤的预后与角膜缘缺血的严重程度有直接关系[6]。研究发现，角膜缘碱烧伤早期组织分泌促血管新生因子的能力缺陷，组织炎症及缺血缺氧诱发的新生血管形成可导致角膜瘢痕、睑球粘连[8]。故此期急救措施中首先要积极改善角膜血管供养状态[7]。因组织炎症及缺血缺氧诱发的新生血管形成可在角膜形成瘢痕，引起睑球粘连[8]。

最初认为，缺血诱导的血管重建仅仅依赖于缺氧、炎症介导的血管新生过程。但最近的研究发现，出生后的血管重建不仅依赖于血管新生，还需骨髓来源的前体干/祖细胞的参与[9]。胚胎发育中的血管生成是指由中胚层衍生的血管干细胞迁移、聚集、分化在原位形成原始毛细血管网[10]，而成体骨髓来源的内皮祖细胞能够趋化、黏附、增殖、分化成内皮细胞并参与血管的重建，这一过程类似于胚胎发育过程中的血管生成，所以被称为出生后或成体的血管生成[11]。后来发现有许多生长因子如粒细胞巨核细胞集落生长因子(GM-CSF)、VEGF等能够募集骨髓来源的干细胞到血管重建所需的部位。而缺血本身不仅能增加血管干细胞的数量，且能够增强干细胞向内皮细胞分化的能力[12]。但缺血诱导的血管重建往往不能完全弥补外周血管病变和动脉闭塞所引起的血流减少，而提供外源性干细胞可增强血管生成，并促进缺血组织的血流恢复。

与血管新生不同，动脉生成的调控不依赖于局部的缺氧，但局部的血流剪切力以及局部内皮活化却发挥着至关重要的作用[13]。动脉生成也称为侧支循环建立，即原先存在的潜在血管在血流压力的作用下增殖生长，形成较粗的能显著促进血流的大动脉[14]。在此过程中，血管平滑肌细胞和周细胞扮演着重要角色，其能调节血流量和血管壁的通透性，促进血管生长；还能通过分泌细胞因子传递信号给内皮和作用于细胞外基质[15]等。侧支循环建立后，内皮细胞表达单核细胞趋化因子和单核细胞黏附分子等[16]。单核巨噬细胞、血小板、肥大细胞以及其他细胞被趋化因子(如VEGF)趋化到炎症和缺血部位[17]。这些细胞能产生促血管新生和促血管生成的因子，如VEGF、成纤维细胞生长因子、IL-8、血小板衍生生长因子等，这些因子反过来吸引更多的内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、白细胞和血小板[18]。这样的一个新环境导致内皮细胞和平滑肌细胞大量增殖、迁移，血管增粗和成熟，细胞外基质的大量合成。最终，小血管重塑形成大的侧支循环，从而提供有效血流量，促进缺血角膜再生[19,20]。

研究发现，在血管新生过程中动脉生成和血管新生常同时发生、发展，不能绝对分开[21]；循环中注射骨髓干/祖细胞的兔血管新生起主要作用[22]。BMSCs既能在VEGF刺激下分化成内皮细胞，也能在PDGF作用下形成平滑肌细胞。在细胞水平上，骨髓来源的干/祖细胞能分化为毛细血管的内皮细胞(血管新生)，亦可形成由平滑肌细胞包被的大血管(血管生成)。尽管这两种机制存在着许多交迭，但目前尚无法明确区分其分子过程。BMSCs对血管新生、血管生成、动脉生成作用的区分也很不清楚。目前所知的细胞生成因子均不是仅对血管重建发生作用；内皮细胞和周细胞/平滑肌细胞的接触在血管成熟中起着尤为重要的作用。如果没有周细胞/平滑肌细胞的参与，新生的裸露内皮细胞管状结构很不稳定，容易退缩和消失。前期研究中我们发现，移植的BMSCs可参与到血管网中并分泌VEGF[2]；外周血和房水中的VEGF浓度变化以及角膜组织中VEGF、VEGFR基因表达水平均证实了上述发现。VEGF能刺激周细胞/平滑肌细胞增殖和募集，进而促进血管生长和成熟。本研究观察组第3、21、60天角膜上皮再生程度评分均低于对照组，第21、60天角膜混浊程度评分均低于对照组。说明静注BMSCs可促进损伤角膜再生，提高角膜透明度。观察组注射BMSCs第3、21天角膜新生血管面积高于对照组，表明静注BMSCs可促进碱烧伤角膜损伤后早期血管新生，进而改善烧伤后早期角膜血供。第60天观察组右眼角膜新生血管面积小于对照组，说明在损伤后期，观察组血管新生程度较低，此可能为观察组右眼角膜透明度较高的原因之一。

综上所述，BMSCs静注可促进碱烧伤兔角膜修复，提高角膜透明度；其机制可能为早期可促进损伤角膜新生血管生成、晚期可抑制角膜新生血管生成。本研究的不足为未对角膜缘组织中的周细胞/平滑肌细胞进行抗体标记。

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天津市应用基础及前沿技术研究项目(15JCYBJC26500)。

韩泉洪(E-mail：hanquanhong126@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.012

R772.2

A

1002-266X(2017)20-0040-03

2016-11-11)